【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及调控豆科植物根瘤共生固氮或结瘤数目的基因ls及其应用。
技术介绍
1、gras是植物特异的转录因子，可以被分成不同的亚家族[1]。在豆科根瘤共生固氮过程中起到重要作用。nodulation signaling pathway 1(nsp1)[2],nsp2[3],della[4,5],hairy meristem 4(ham4)[6],shortroot-scarecrow(shr-scr)module[7]and scarecrowlike 13(scl13)involved in nodulation(sin1)[8].我们发现ls在豆科物种中都没有同源基因，在非豆科物种中都有同源基因，是豆科丢失的基因。番茄中的ls[9],拟南芥中lateralsuppressor(las)[10]和水稻中的moc1基因[11]都是ls亚家族的基因，负责分枝或分蘖发育。水稻中moc1的调控机制已经被详细报道。moc1可以被tillering and dwarf 1(tad1)降解[12,13]，tad1是蒺藜苜蓿cell cycle switch52(ccs52a)的同源基因。ccs52a参与共生细胞的分化[14]。此外，moc1结合della蛋白slender rice 1(slr1)从而不被降解[15]，而蒺藜苜蓿中della与dmi3(ipd3,orthologue of lotus japonicus cyclops)和nsp2形成复合体调控根瘤共生[4,5]。moc1和monoculm 3(moc3)通
技术实现思路
1、在农作物育种中，结瘤数目过多或过少均会影响农作物的产量，因此需要对结瘤数目进行调控[20]。本专利技术的目的是提供一种调控豆科植物根瘤共生固氮的基因及其应用。
2、专利技术人运用分子生物学和比较基因组学的手段，分别从oryza satival.ssp.japonica中克隆到一个调控大豆(glycine max)和蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)结瘤数目的相关基因loc_os06g40780(在本文中也称为monoculm 1,moc1)和loc_os02g10360(在本文中也称为os7)，从番茄(solanum lycopersicum)种系heinz 1706中克隆到一个调节大豆和蒺藜苜蓿结瘤数目的moc1和os7的同源基因solyc07g066250.1(在本文中也称为lateral suppressor,ls)。moc1编码基因在msu v7.0版本测序基因组中的位置为chr6:24311420..24316382，os7编码基因在msu v7.0版本测序基因组中的位置为chr2:5451819..5453090。ls编码基因在itag2.4版本测序基因组中的位置为sl2.50ch07:67734548..67735834。moc1,os7和ls的克隆为后续分子辅助育种和分子设计育种提供理论基础和基因资源。
3、其中，在本专利技术的具体实施方案中，所述moc1基因的cdna序列如seq id no:1所示，所述os7基因的cdna序列如seq id no:2所示，所述ls基因的cdna序列如seq id no:3所示。在本专利技术的具体实施方案中，所述moc1基因的氨基酸序列如seq id no:4所示，所述os7基因的氨基酸序列如seq id no:5所示,所述ls基因的氨基酸序列如seq id no:6所示。
4、专利技术人发现，moc1蛋白、os7蛋白和ls蛋白在利用植物表达载体如发根农杆菌进行过表达时，与来源种系相比，获得的植株的结瘤数目出现了显著减少。这样的效果是基于现有的技术预料不到的，由此，专利技术人发现了一种分离的蛋白质，其为抑制大豆和蒺藜苜蓿根瘤菌共生固氮相关蛋白。
5、本专利技术中，可用现有的植物表达载体构建含有目的基因的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述植物表达载体中还可以包含增强子，以增加插入的核苷酸片段的表达。
6、为实现上述目的，本专利技术还提供一种获得转基因毛状根的方法，其是将前述核酸或包含前述基因的载体或宿主细胞导入目的豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿中，得到与所述目的豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿相比表现为结瘤数目改变的豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿毛状根。
7、为实现上述目的，本专利技术还提供一种如前所述的蛋白质或如前所述的核酸或包含前述基因的载体或宿主细胞在豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿基因工程中的应用。
8、本专利技术提供的大豆和蒺藜苜蓿结瘤数目相关蛋白及其编码核酸在调控大豆和蒺藜苜蓿结瘤数目方面的功能均为申请人的首次发现，且经过转基因毛状根和转空载体毛状根植株的表型分析验证说明表达本专利技术的大豆和蒺藜苜蓿结瘤数目相关蛋白能够使大豆或蒺藜苜蓿转基因毛状根结瘤数目减少。本专利技术对于调节大豆或蒺藜苜蓿根瘤数目及其相关应用研究将具有重大理论和应用价值。
9、具体来说，本专利技术提供以下技术方案：
10、一方面，本专利技术提供分离的调控大豆或蒺藜苜蓿结瘤数目的基因，所述基因的编码区序列如seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3所示或其同源序列。
11、另一方面，本专利技术提供调控大豆或蒺藜苜蓿结瘤数目的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6所示或其同源序列。
12、另一方面，本专利技术提供表达载体，所述表达载体包含如上所述的基因或编码如上所述的蛋白质的核苷酸序列，或包含抑制如上所述的基因或如上所述的蛋白质的表达的序列，例如所述基因的干扰序列或编码所述蛋白质的核苷酸序列的干扰序列。
13、在一些实施方案中，所述表达载体包含标记，任选地，所述标记选自发光标记、抗生素标记和抗化学试剂标记，任选地，所述发光标记选自红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，所述抗生素本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.分离的调控豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿结瘤数目的基因，其特征在于，所述基因的编码区序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示或其同源序列。
2.调控豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿结瘤数目的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示或其同源序列。
3.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含根据权利要求1所述的基因或编码根据权利要求2所述的蛋白质的核苷酸序列，或包含抑制根据权利要求1所述的基因或根据权利要求2所述的蛋白质的表达的序列，例如所述基因的干扰序列或编码所述蛋白质的核苷酸序列的干扰序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含标记，任选地，所述标记选自发光标记、抗生素标记和抗化学试剂标记，任选地，所述发光标记选自红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，所述抗生素标记选自氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、利福平、壮观霉素、潮霉素、链霉素和四环素，所述抗化学试剂标记例如抗除草剂标记。
5.根据权利要求3或4
6.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含根据权利要求3-5中任一项所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞(例如发根农杆菌细胞)或植物细胞，任选地，所述发根农杆菌选自K599、AR1193、C58cl、Arqual、MSU440、LBA9402、和R1601。
8.培育产量提高或结瘤数目改变的豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿的方法，其特征在于，所述方法包括将根据权利要求1所述的基因或编码根据权利要求2所述的蛋白质的核苷酸序列或根据权利要求3-5中任一项所述的表达载体或根据权利要求6或7所述的宿主细胞引入豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿的细胞或组织中培育，获得产量提高或结瘤数目改变的植物，任选地，根据需要所述结瘤改变表现为结瘤数目和/或单位根长结瘤数目增加，任选地，根据需要所述结瘤改变表现为结瘤数目和/或单位根长结瘤数目减少。
9.根据权利要求1所述的基因或编码根据权利要求2所述的蛋白质的核苷酸序列或根据权利要求3-5中任一项所述的表达载体或根据权利要求6或7所述的宿主细胞在培育产量提高或结瘤数目改变的豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿中的用途，任选地，根据需要结瘤数目改变表现为根瘤数目和/或单位根长根瘤数目增加，任选地，根据需要所述结瘤改变表现为结瘤数目和/或单位根长结瘤数目减少。
10.获得豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿毛状根的方法，其包括将根据权利要求3-5中任一项所述的表达载体或权利要求6或7所述的宿主细胞转化到豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿植物细胞或组织中并培育，获得结瘤数目改变的转基因毛状根，任选地，根据需要所述结瘤改变表现为结瘤数目和/或单位根长结瘤数目增加，任选地，根据需要所述结瘤改变表现为结瘤数目和/或单位根长结瘤数目减少。
...【技术特征摘要】
1.分离的调控豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿结瘤数目的基因，其特征在于，所述基因的编码区序列如seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3所示或其同源序列。
2.调控豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿结瘤数目的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6所示或其同源序列。
3.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含根据权利要求1所述的基因或编码根据权利要求2所述的蛋白质的核苷酸序列，或包含抑制根据权利要求1所述的基因或根据权利要求2所述的蛋白质的表达的序列，例如所述基因的干扰序列或编码所述蛋白质的核苷酸序列的干扰序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含标记，任选地，所述标记选自发光标记、抗生素标记和抗化学试剂标记，任选地，所述发光标记选自红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，所述抗生素标记选自氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、利福平、壮观霉素、潮霉素、链霉素和四环素，所述抗化学试剂标记例如抗除草剂标记。
5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，所述载体为植物表达载体，包括双元农杆菌载体和/或可用于植物微弹轰击的载体。
6.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含根据权利要求3-5中任一项所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞(例如发根农杆菌细胞)或植物细胞，任...
【专利技术属性】
技术研发人员：田志喜，谢芳，刘腾飞，袁亚钦，范敬伟，刘智，刘海月，刘书林，刘羽诚，申妍婷，张敏，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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