一种快速检测迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析试纸条，该发明专利技术涉及一种利用纳米胶体金颗粒标记抗体技术和双抗体夹心免疫层析法检测抗原模式，制备了迟缓爱德华氏菌的胶体金免疫层析检测试纸条。提供一种迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用。该试纸条含有样品垫、金标垫、带有检测线和质控线抗体的硝酸纤维素膜、吸收垫、底板，将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次重叠相连粘贴在底板上组装而成。本试纸条检测应用操作简单、特异性好、灵敏度高、方便快速，不需要特速仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广。适合用于对迟缓爱德华氏菌的感染、污染的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种快速检测迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析试纸条及其制备和在迟缓爱德华氏菌检测上的应用。
技术介绍
迟缓爱德华菌氏病是养殖渔业中暴发性的一类细菌性疾病，流行于叉尾鲴科、鳗鲡科及牙鲆、鲤等经济养殖鱼类，主要导致鱼类的肝、肾病。该病多发于春夏之变、秋季等高水温期，夏季达到高峰，其流行面积广，死亡率较高，危害十分严重，已引起水产养殖业的高度重视。对迟缓爱德华菌氏病的检测鉴定，目前主要局限于细菌学检查或病理观察，按常规的细菌分离鉴定诊断复杂费时，易延误防治时机。另外，也有利用兔抗爱德华氏菌多克隆抗体、抗爱德华氏菌单克隆抗体建立的ELISA检测方法应用于爱德华氏菌的免疫学检测。虽然ELISA检测也能在几小时内诊断出爱德华氏菌病，具有较高的特异性和灵敏度，但存在操作技术要求高、设备比较昂贵等缺点，不便于基层生产应用。基于迟缓爱德华菌在水产动物中的流行状况以及防治要求，开发研究便捷快速、灵敏特异的检测技术已成为一种迫切的需要。本专利技术基于免疫学检测原理和单克隆抗体、多克隆抗体制备技术及胶体金标记技术，研制了一种迟缓爱德华氏菌的胶体金免疫层析检测试纸条。胶体金免疫层析检测试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术，近十多年来，胶体金标记已经发展为继同位素标记、酶标记以及荧光标记以后的一项重要的免疫标记技术。由于其快速、便捷，不需特殊设备，结果判断直观等优势，近年来该方法得到快速发展，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用，但用于动物疾病防控检测领域的产品较少。本研究针对迟缓爱德华氏菌研制出了水产疾病检测的免疫胶体金检测试纸条，研制出相应的快速诊断试剂盒将有力的促进水产养殖业对细菌性病害的有效控制防治。研究建立的胶体金检测方法灵敏、准确、特异性强，此方法建立后，同时可与经典常规方法互补，预计将在水产动物诊疗机构、水产动物养殖企业、检验检疫部门等具有较广的应用前景，有一定的经济和社会效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可用于检测迟缓爱德华氏菌的灵敏、准确、快速的胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法和在迟缓爱德华菌氏检测上的应用。本专利技术提供了迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于该试纸条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、底板，在底板上以样品垫为起始端，依次重叠粘贴固定样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫。本专利技术提供了迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条的制备包括以下步骤(1)制备抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体或多克隆抗体；(2)纳米胶体金颗粒的制备；(3)制备抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体或多克隆抗体的胶体金标记物，形成金标抗体；(4)将金标抗体均勻喷涂到玻璃纤维素膜上，经干燥形成金标垫；(5)将抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体或抗迟缓爱德华氏菌多克隆抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的检测线位置作为检测线捕获抗体，抗金标抗体的二抗或葡萄球菌A蛋白喷涂到硝酸纤维素膜上的质控线位置作为质控线捕获抗体，封闭空白位点，充分干燥；(6)将吸收垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、底板组装成胶体金免疫层析检测试纸条。附图说明图1为本专利技术迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条的组装结构图，其中1 是样品垫；2是金标垫；3是检测线显色位置；4是质控线显色位置；5是硝酸纤维素膜；6是吸收垫；7是底板。图2为本专利技术迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条的外观结构图，其中8 是塑料外壳；9是结果读取窗口 ；10是检测样品加样区。具体实施例方式本专利技术的具体实施方式参照下面的实施例进行详细说明，但并不局限于此。本检测试纸条的制备包括以下步骤抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体细胞株的建立、兔抗迟缓爱德华氏菌多克隆抗体血清的制备、配对抗体的选择、纳米胶体金颗粒的制备、纳米胶体金标记PH值优化、纳米胶体金标记蛋白浓度优化、金标垫的制备、硝酸纤维素膜上的检测线与质控线抗体的喷涂及封闭、试纸条的组装、检测方法。实施例1、抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体细胞株的建立制备迟缓爱德华氏菌灭活抗原，免疫Balb/c小鼠，免疫之后制备脾细胞悬液；同时制备骨髓瘤细胞悬液；将脾细胞与骨髓瘤细胞经过细胞杂交融合，筛选阳性单克隆细胞孔；经进一步的阳性克隆化及其筛选，建立抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株2 株，分别命名为ETMcAb3A7、ETMcAb4Fll。该2株细胞株已于2010年6月6日在中国典型培养物保藏中心保藏(中国.武汉.武汉大学)，保藏编号分别为CCTCC NO :C201061和CCTCC NO :C201062。实施例2、抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体腹水的制备培养抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体细胞株ETMcAb3A7、ETMcAb4Fll，分别收集单克隆抗体细胞，分别腹腔注射Balb/c小鼠，洁净环境饲养。约7-10d后观察小鼠腹部，有明显腹水者用12#针头由腹腔下侧穿刺回收腹水，3000r ^irT1离心5min，沉淀红细胞及血细胞， 收集上层淡黄色的腹水，保存备用。实施例3、兔抗迟缓爱德华氏菌多克隆抗体血清的制备制备迟缓爱德华氏菌灭活抗原，首免加等量的完全弗氏佐剂，注射新西兰兔，2-3 周内进行二免，抗原加等量不完全弗氏佐剂，一个月后三免。免疫结束后，通过颈动脉割取血，经5000r · miiT1离心后收集血清，无菌分装，-80°C保存备用。实施例4、配对抗体的选择配对抗体的选择是选用已经制备的抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体、多克隆抗体， 将所有相关抗体作配对实验后，选择灵敏度、特异性较好的一组抗体，分别用于胶体金标记和硝酸纤维素膜检测线捕获抗体的喷涂。我们选择了实验室制备的抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体ETMcAb3A7、ETMcAb4Fll 与兔抗迟缓爱德华氏菌多克隆抗体，两两经过夹心法实验与金标抗体免疫层析实验，最后选择一对效果最佳抗体。实验结果表明，抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体ETMcAb3A7与 ETMcAb4Fll分别做为胶体金标记抗体、检测线抗体为最佳组合，该方案实施可降低样品检测中假阴性信号的出现，提高抗体的胶体金标记效果，并能获得可靠的结果。实施例5、纳米胶体金颗粒的制备取250mL三角瓶一个，制备氯化金IOOmL,加热沸腾；取ImL的柠檬酸钠加入上述溶液中，迅速混合均勻，再保持沸腾15min，自然冷却后蒸馏水恢复至IOOmL体积； 胶体金溶液用硅化过的试剂瓶4 °C保存，备用。胶体金烧制之后，静置4h后观察，若胶体金溶液表面有漂浮物，则弃取，重新烧制；4 °C保存的胶体金溶液表面若有漂浮物或絮状沉淀，也应弃取，重新烧制。实施例6、纳米胶体金标记pH值优化取若干个5mL试管，分别加入1. 5mL 20nm胶体金；用0. 05moL · Γ1 K2CO3和 0. ImoL · L^1HCl将胶体金溶液的pH调为6 10 ；取1. 5ml离心管，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取ImL加入管中，重复三次；每孔分别加入单克隆抗体200 μ L，浓度为 Img · mL—1，迅速混勻，混合，室温下放置30min ；每孔分别加入5 % KCl 50 μ L，混勻后静置 4h ；观察胶体金颜色变化，记录颜色变化较小的组，优选PH为8. 0-9. 8 ；在优选pH范围内调整，重复上本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种迟缓爱德华氏菌的胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于：该试纸条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、底板。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：樊海平，辛志明，吴斌，曾占壮，张新艳，
申请(专利权)人：福建省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：35
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