适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基制造技术

本发明专利技术揭示了一种适于幼仓鼠肾细胞（BHK细胞）大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基，包括21种氨基酸、11种无机盐、12种维生素、1种蛋白水解物、2种脂类、2种缓冲成分和6种添加物。本发明专利技术的BHK细胞无血清培养基单细胞悬浮培养生产生物制品，既可避免有血清培养的种种不利因素，又可以消除滚瓶贴壁培养难以规模放大的问题，从而提高BHK细胞培养的生产效率并降低生产成本，同时确保产品的质量，具有良好的应用价值和巨大的市场前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养基领域，尤其涉及一种适用于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基。
技术介绍
狂犬病是由狂犬病毒所致的自然疫源性或动物源性人畜共患急性传染病，流行性广，病死率极高，对犬进行严格管理、犬免疫或灭犬，是控制人狂犬病的积极有效方法。目前对该病尚无特殊有效的治疗方法，病死率几乎100%。口蹄疫是偶蹄动物的一种急性、热性、 高度接触性传染病，其病毒变异和流行传播速度都极快，可感染70多种家养和野生的偶蹄动物，在世界范围内对畜牧业及相关产业造成相当大的影响，世界动物卫生组织将其列为必须申报的传染病，我国将其列在一类动物传染病的首位。疫苗接种是成功预防、控制乃至最终消灭口蹄疫的最有效手段。伪狂犬病对国内畜牧养殖业的发展带来了不利影响。除各种年龄的猪、牛都易感外，在自然条件下使羊、犬、猫、兔、鼠、水貂、狐等动物感染发病。实验动物中家兔、豚鼠、小鼠都易感。其中以家兔最敏感。中国现在用幼仓鼠肾细胞(BHK细胞) 制造的狂犬疫苗系、口蹄疫疫苗系和伪狂犬疫苗系全部或者部分采用BHK细胞生产，现在国内的生产工艺多采用MEM添加10%血清滚瓶贴壁培养，较国外无血清生物反应器高密度悬浮培养工艺落后甚多。除了上述动物疫苗产品外，许多生物技术方面的新近进展，如重组蛋白、抗体、经由BHK细胞生产的，都需要大规模的体外细胞培养，这就需要相当多的细胞培养基。然而，常规的细胞培养基中的血清和血清蛋白是有问题的，并且对大规模生物反应器培养而言成本上是不允许的，现有技术中描述的其他血清替代方法在大量使用时也是很昂贵。大多数商业上可获得的培养基的主要问题是需要向培养基提供大量的血清成分(一般为5% 20%)，由于血清的高价格和有限的可获得性，造成了一个显著的限制因子。此外， 从生产的角度来说，在培养基中添加动物血清和/或血清白蛋白会使下游产品纯化更加复杂，并且其中可能污染的病毒也是严重的安全问题。更进一步地，血清存在批次稳定性问题。因此，对于大规模生物反应器发酵所需要的是一种以相当低的成本提供细胞生长所需基本营养的、生物和生物物理必需品的细胞培养基，可提供极好的细胞生长和最大细胞密度的性能，并且也易于从相对较少数量的低成本成分制备得来。优选地，该培养基应该不含血清。国内外均缺少专门针对BHK细胞培养的无血清培养基，如文献[1]报道使用国际上主流的商业化培养基Hyclone的HyQ PF CH0,HyQ PF CHO MPS培养基，JRH的ExCe 11302， ExCell520培养基以及默克的Rencyte BHK培养基来悬浮培养BHK细胞，最大细胞密度仅仅达到了 2. 2 X IO6细胞数/毫升，不及已开发的BHK低血清培养基悬浮培养最大细胞密度 8. OX IO6细胞数/毫升的30%。另外一些文献报道的BHK-21无血清培养的最大细胞密度也均在2.0X106细胞数/毫升左右[2’3]。国内的培养基龙头企业清大天一的产品MD611培养基可以有效的作为BHK细胞贴壁培养的低血清培养基，此外，清大天一开发出可以悬浮培养BHK细胞的低血清培养基，并未申请专利，同时尚未公开销售。即使清大天一的低血清培养基，悬浮培养BHK细胞的密度也仅仅达到了 4X IO6细胞数/毫升M。综上所述，开发低成本的可以用于规模化生产中并且不含血清的BHK细胞成本有效性无血清培养基对国内动物疫苗行业的发展的具有重要意义。参考文献1.H Kallel, Jouini, S Majoul, S Rourou. Evaluation of various serum and animal protein free media for the production of a veterinary rabies vaccine in BHK-21 cells. Biotechnol. 95(2002)195-204.2.The new medium MDSS2N, free of any animal protein supports cell growth and production of various viruses. Off Merten, H Kallel, JC Manuguerra, M Tardy-Panit, R Crainic, F Delpeyroux, S Van der Werf， P Perrin. Celltechnol. 30(1999) 191-201.3.H Kallel, S Rourou, S Majoul, H Louki1. A novel process for the production of a veterinary rabies vaccine in BHK—21 cells grown on microcarriers in a 20-1 bioreactor. App 1 Microbiol Biotechnol. 61(2003)441-446.4.细胞培养手册2011版，清大天一，2011。
技术实现思路
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提出一种适用于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基，既可避免有血清培养基的种种不利因素，又可以消除滚瓶贴壁培养难以规模放大的问题。本专利技术的目的将通过以下技术方案得以实现一种适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于包括氨基酸，无机盐，维生素，蛋白水解物，脂类，缓冲成分和添加物；所述氨基酸为L-色氨酸， L-半胱氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-缬氨酸，L-精氨酸盐酸盐，L-组氨酸盐酸盐，L-赖氨酸，L-蛋氨酸，L-谷氨酸，L-苯丙氨酸，L-天冬酰，甘氨酸，L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-天冬氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-谷氨酰胺，L-胱氨酸盐酸盐以及L-酪氨酸二钠盐；所述无机盐为六水氯化镁，无水硫酸镁，无水氯化钙，氯化钾，氯化钠，一水磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，七水合硫酸锌，九水合硝酸铁，亚硒酸钠以及五水硫酸铜；所述维生素为肌醇，维生素 C，磷酸吡哆醇，磷酸吡哆醛，钴铵素，烟酰胺，核黄素，盐酸硫胺素，D-泛酸钙，叶酸，生物素 (Biotin)以及氯化胆碱；所述蛋白水解物为大米水解物；所述脂类为亚油酸和嵌段式聚醚 F-68 (Pluronic F-68)；所述缓冲成分为碳酸氢钠和羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)；所述添加物为D-葡萄糖，丙酮酸钠，还原型谷胱甘肽，次黄嘌呤钠盐，腐胺和硫辛酸。优选的，上述的适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基，其中 所述氨基酸的含量以毫克/升计为L-色氨酸15 750L-半胱氨酸5 204L-异亮氨酸27 480L-亮氨酸 L-缬氨酸 L-精氨酸盐酸盐 L-组氨酸盐酸盐 L-赖氨酸 L-蛋氨酸 L-谷氨酸 L-苯丙氨酸 L-天冬酰胺甘氨酸 L-脯氨酸 L-丙氨酸 L-天冬氨酸 L-丝氨酸 L-苏氨酸 L-谷氨酰胺 L-胱氨酸盐酸盐 L-酪氨酸二钠盐30 2048 30 30 224 -25 47 3 -840 -620 -698 -780 -480 -190 30 -96 -600 2417. 25 500 3 25 3 20. 5 27 670 50 500 365本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．　一种适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于：包括氨基酸，无机盐，维生素，蛋白水解物，脂类，缓冲成分和添加物；所述氨基酸为Ｌ－色氨酸，Ｌ－半胱氨酸，Ｌ－异亮氨酸，Ｌ－亮氨酸，Ｌ－缬氨酸，Ｌ－精氨酸盐酸盐，Ｌ－组氨酸盐酸盐，Ｌ－赖氨酸，Ｌ－蛋氨酸，Ｌ－谷氨酸，Ｌ－苯丙氨酸，Ｌ－天冬酰，甘氨酸，Ｌ－脯氨酸，Ｌ－丙氨酸，Ｌ－天冬氨酸，Ｌ－丝氨酸，Ｌ－苏氨酸，Ｌ－谷氨酰胺，Ｌ－胱氨酸盐酸盐以及Ｌ－酪氨酸二钠盐；所述无机盐为六水氯化镁，无水硫酸镁，无水氯化钙，氯化钾，氯化钠，一水磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，七水合硫酸锌，九水合硝酸铁，亚硒酸钠以及五水硫酸铜；所述维生素为肌醇，维生素Ｃ，磷酸吡哆醇，磷酸吡哆醛，钴铵素，烟酰胺，核黄素，盐酸硫胺素，Ｄ－泛酸钙，叶酸，生物素以及氯化胆碱；所述蛋白水解物为大米水解物；所述脂类为亚油酸和嵌段式聚醚Ｆ－６８；所述缓冲成分为碳酸氢钠和羟乙基哌嗪乙磺酸；所述添加物为Ｄ－葡萄糖，丙酮酸钠，还原型谷胱甘肽，次黄嘌呤钠盐，腐胺和硫辛酸。

【技术特征摘要】
1.一种适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于包括氨基酸，无机盐，维生素，蛋白水解物，脂类，缓冲成分和添加物；所述氨基酸为L-色氨酸，L-半胱氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-缬氨酸，L-精氨酸盐酸盐，L-组氨酸盐酸盐，L-赖氨酸，L-蛋氨酸，L-谷氨酸，L-苯丙氨酸，L-天冬酰，甘氨酸，L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-天冬氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-谷氨酰胺，L-胱氨酸盐酸盐以及L-酪氨酸二钠盐；所述无机盐为六水氯化镁，无水硫酸镁，无水氯化钙，氯化钾，氯化钠，一水磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，七水合硫酸锌，九水合硝酸铁，亚硒酸钠以及五水硫酸铜；所述维生素为肌醇，维生素C，磷酸吡哆醇，磷酸吡哆醛，钴铵素，烟酰胺，核黄素，盐酸硫胺素，D-泛酸钙，叶酸，生物素以及氯化胆碱； 所述蛋白水解物为大米水解物； 所述脂类为亚油酸和嵌段式聚醚F-68 ； 所述缓冲成分为碳酸氢钠和羟乙基哌嗪乙磺酸；所述添加物为D-葡萄糖，丙酮酸钠，还原型谷胱甘肽，次黄嘌呤钠盐，腐胺和硫辛酸。2.根据权利要求1所述的适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基， 其特征在于所述氨基酸的含量以毫克/升计为L-色氨酸15 ‘ 750L-半胱氨酸5 ‘204L-异亮氨酸27 ‘ 480L-亮氨酸30 ‘ 840L-缬氨酸20 ‘ 620L-精氨酸盐酸盐48 ‘ 698L-组氨酸盐酸盐30 ‘ 780L-赖氨酸30 ‘ 480L-蛋氨酸22 ‘ 190L-谷氨酸4 ‘30L-苯丙氨酸25 ‘ 96L-天冬酰胺47 ‘ 600甘氨酸3 24L-脯氨酸17.25 5(L-丙氨酸3 ‘25L-天冬氨酸3 ‘20. 5L-丝氨酸27 ‘ 670L-苏氨酸50 ‘ 500L-谷氨酰胺365 584L-胱氨酸盐酸盐32 ‘ 64L-酪氨酸二钠盐56 ‘ 100。3.根据权利要求1所述的适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基， 其特征在于所述维生素的含量以毫克/升计为维生素C0.1 15磷酸吡哆醇0.2 2磷酸吡哆醛0.001 0. 1钴铵素0.03 -一 3烟酰胺0.1 5核黄素0.1 0. 8盐酸硫胺素0.2 5氯化胆碱1 8D-泛酸钙0.1 -4叶酸0.1 4生物素0.003 0. 1肌醇2 10。4.根据权利要求1所述的适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基， 其特征在于所述无机盐的含量以毫克/升计为六水氯化镁1 60无水硫酸镁1 60无水氯化钙5 160氯化钾50 400氯化钠3000 7000一水磷酸二氢钠40 200磷酸氢二钠10 180七水合硫酸锌0. 1 0. 5九水合硝酸铁0. 01 0. 5亚硒酸钠0. 001 0. 02五水硫酸铜0. 0001 0. 002。5.根据权利要求1所述的适于幼仓鼠肾细胞大规模单细胞悬浮培养的无血清培养基， 其特征在于所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大鹤，滕小锘，龚迪，
申请(专利权)人：上海米迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31