一种三白草悬浮细胞的快速繁殖方法技术

本发明专利技术研究了一种三白草悬浮细胞的快速繁殖方法，包括三白草无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养等步骤，本发明专利技术方法所制备的三百草细胞繁殖速度快，细胞培养物性质状态均一，研究建立了细胞培养体系，以期为三百草细胞培养的相关研究提供技术原理和工艺基础。

【技术实现步骤摘要】
—种三白草悬浮细胞的快速繁殖方法
本专利技术涉及一种三白草悬浮培养的快繁方法，属于生物
。
技术介绍
三白草，又称:水木通，五路白、白水鸡，五叶白、白桔朝、白花照水莲，天性草等，Saururuschinensis (Lour.)Baill.,多年生草本,常生湿地。单叶，互生,具和叶柄连生的托叶。花两性，整齐，成穗状或总状花序，无花被；雄蕊3?6?8，下位或合著于子房而近乎上位，花丝分离，花药两室，纵裂；花粉粒具单槽，偶具3岐槽，外壁层次模糊，槽具颗粒状膜，子房上位或半下位，心皮3?4，分离，基部结合为一，通常每心皮有2?10个直生胚珠，但三白草属常每心皮只有一胚珠。果实为半浆质的瞢莢或肉质而顶端裂开的蒴果，化学成份:三白草叶含槲皮素，槲皮甙，异槲皮甙，槲皮素，槲皮甙，金丝桃甙及芸香甙。茎、叶均含可水解鞣质。全草含水量挥发油，其主成分为甲基壬基甲酮。生长在沟边、池塘边沼泽等近水低湿处。分布于我国长江流域以南各省均有分布，主产江苏、浙江、湖南、广东。全年均可采，以夏秋季为宜，收取地上部分，洗净，晒干，主要功能主治:热淋；血淋；水肿；脚气；黄疸；痢疾；带下；痈肿疮毒；湿疹；蛇咬伤，喜温湿润气候，耐荫，凡塘边、沟边、溪边等浅水处或低洼地均可栽培。发芽需低温，在7.6-12.4°C有光照条件，用种子繁殖。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，由该方法所制备的三白草细胞繁殖速度快，培养规模大，细胞培养物性质状态均一，研究建立了细胞培养体系，以期为三百草细胞培养的相关研究提供技术原理和工艺基础。 本专利技术所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的:取三百草幼嫩的叶片，毛刷蘸肥皂水轻拭，刷净叶片表面污物，置于烧杯中，自来水冲洗45min，在超净工作台上用70%乙醇浸泡15s，无菌水冲洗2min，0.1%的升汞消毒12min，无菌水冲洗5次，吸水纸吸干，消毒处理过的三白草幼嫩的叶片接入HE+2，4-Dl.5mg/L+6-BA3.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，暗培养一周后转入光照培养，光照强度21001x，光照时间10h/d，温度23°C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基 1/3MS+1.0-1.2mg/LNAA+l.0-1.2mg/L6-BA+0.4-0.5mg/L2, 4-D 进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，pH5.8，光照40001x，光照时间16h/d，温度25°C，悬浮细胞培养的条件为接种量为10%，40mL培养基放入200ml容量瓶中，摇床转速10rPm,培养周期为40d。 采用本专利技术制备的悬浮细胞增长率高，周期短，产量大，污染小，利于大规模种植。 下面将结合【具体实施方式】对本专利技术作进一步阐述，但本专利技术要求保护的范围并不局限于下列实施方式。 【具体实施方式】 实施例1取三百草幼嫩的叶片，毛刷蘸肥皂水轻拭，刷净叶片表面污物，置于烧杯中，自来水冲洗45min，在超净工作台上用70%乙醇浸泡15s，无菌水冲洗2min，0.1%的升汞消毒12min，无菌水冲洗5次，吸水纸吸干，消毒处理过的三白草幼嫩的叶片接入HE+2，4-D1.5mg/L+6-BA3.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，暗培养一周后转入光照培养，光照强度21001x，光照时间10h/d，温度23°C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基1/3MS+1.0mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.4mg/L2, 4-D进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，pH5.8，光照40001x，光照时间16h/d，温度25°C，悬浮细胞培养的条件为接种量为10%，40mL培养基放入200ml容量瓶中，摇床转速10rPm,培养周期为40d，增长率提高46%。 实施例2取三百草幼嫩的叶片，毛刷蘸肥皂水轻拭，刷净叶片表面污物，置于烧杯中，自来水冲洗45min，在超净工作台上用70%乙醇浸泡15s，无菌水冲洗2min，0.1%的升汞消毒12min，无菌水冲洗5次，吸水纸吸干，消毒处理过的三白草幼嫩的叶片接入HE+2，4-D1.5mg/L+6-BA3.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，暗培养一周后转入光照培养，光照强度21001x，光照时间10h/d，温度23°C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基1/3MS+1.2mg/LNAA +1.2mg/L6-BA+0.5mg/L2, 4-D进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，pH5.8，光照40001x，光照时间16h/d，温度25°C，悬浮细胞培养的条件为接种量为10%，40mL培养基放入200ml容量瓶中，摇床转速10rPm,培养周期为40d，增长率54%。 实施例3取三百草幼嫩的叶片，毛刷蘸肥皂水轻拭，刷净叶片表面污物，置于烧杯中，自来水冲洗45min，在超净工作台上用70%乙醇浸泡15s，无菌水冲洗2min，0.1%的升汞消毒12min，无菌水冲洗5次，吸水纸吸干，消毒处理过的三白草幼嫩的叶片接入HE+2，4-D1.5mg/L+6-BA3.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，暗培养一周后转入光照培养，光照强度21001x，光照时间10h/d，温度23°C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基1/3MS+1.2mg/LNAA+l.0mg/L6-BA+0.5mg/L2, 4-D进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，pH5.8，光照40001x，光照时间16h/d，温度25°C，悬浮细胞培养的条件为接种量为10%，40mL培养基放入200ml容量瓶中，摇床转速10rPm,培养周期为40d，增长率52%。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三白草悬浮细胞的快速繁殖方法，包括三白草无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养等，其主要步骤如下：（1）取三白草幼嫩的叶片，进行消毒处理；（2）取步骤（1）消毒处理过的三白草幼嫩的叶片接入HE+2,4‑D1.5mg/L+6‑BA3.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，暗培养一周后转入光照培养，光照强度2100lx，光照时间10h/d，温度23℃；（3）取步骤（2）诱导出来的愈伤组织放入液体培养基1/3MS+1.0‑1.2mg/LNAA +1.0‑1.2mg/L6‑BA+0.4‑0.5mg/L2,4‑D进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，pH5.8，光照4000lx，光照时间16h/d，温度25℃。

【技术特征摘要】
1.一种三白草悬浮细胞的快速繁殖方法，包括三白草无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养等，其主要步骤如下: (1)取三白草幼嫩的叶片，进行消毒处理； (2)取步骤(I)消毒处理过的三白草幼嫩的叶片接入HE+2，4-D1.5mg/L+6-BA3.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，暗培养一周后转入光照培养，光照强度21001x，光照时间10h/d，温度23°C ； (3 )取步骤(2 )诱导出来的愈伤组织放入液体培养基1/3MS+1.0-1.2mg/LNAA+1.0-1.2mg/L6-BA+0.4-0.5mg/L2, 4-D 进行液体悬浮细...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘东锋，杨成东，
申请(专利权)人：南京帝道农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32