基于MAGE-A3基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于MAGE-A3基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒。本发明专利技术提供的试剂盒，包括特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本发明专利技术的试剂盒，不仅可以应用于定性诊断多发性骨髓瘤，还可以通过内参基因，测定患者MAGE-A3基因的表达水平。本发明专利技术为多发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明专利技术将在医学检测领域发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于MAGE-A3基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂品.ο
技术介绍
多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是威胁生命的浆细胞性恶性肿瘤，在血液恶性肿瘤中发病率位于第二位。尽管干细胞移植以及新型药物治疗可以使病情得到有效控制，但很少有患者能够取得完全缓解甚至治愈，复发和死亡的结局仍不可避免。分子生物学的发展使越来越多的肿瘤相关基因为人们所认知，这些重要的分子标志已在血液系统恶性肿瘤的诊断和治疗中发挥了极大的作用，在MM中虽然已发现涉及免疫球蛋白基因重排、C-MYC、RAS癌基因突变及人类端粒酶逆转录酶mRNA过度表达等，但缺乏公认的肿瘤相关的特异性诊断、微小残留病检测和预后评估的分子靶标。癌睾丸抗原(Cancer testis antigen，CT抗原)基因是与恶性肿瘤相关的基因家族，编码免疫原性蛋白质，在过去15年间已鉴定了 40多个家族，表达特点是限制性表达于正常组织睾丸、卵巢和胚胎滋养层细胞，其他正常组织几乎不表达，而在多种肿瘤组织中有不同频率的表达，且可诱导抗体介导和T细胞介导的免疫反应。基于其在肿瘤患者及正常组织中的表达特点和免疫原性，CT抗原已被认为是有应用前景的人类恶性肿瘤免疫治疗的靶标，并有可能成为重要的诊断和预后标志。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于MAGE-A3基因辅助诊断多发性骨髓瘤患者的定量检测试剂盒。本专利技术保护一种辅助诊断多发性骨髓瘤患者的试剂盒，包括特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述试剂盒还可包括阳性质粒；所述阳性质粒为含有MAGE-A3基因(NCBI基因库序列号匪_00536幻或其片段的重组质粒。所述阳性质粒可为含有序列表的序列7所示的 MAGE-A3基因片段的重组质粒。所述阳性质粒具体可为将PMD18-T载体与序列表的序列7 所示的MAGE-A3基因片段连接得到的重组质粒。所述试剂盒还可包括针对内参基因的特异性引物对乙和探针乙；所述内参基因为 ABL基因(NCBI基因库序列号NM_005157)。所述特异性引物对乙具体可为序列表的序列4 所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述探针乙的核苷酸序列具体可如序列表的序列6所示。所述试剂盒还可包括内参质粒；所述内参质粒为含有ABL基因或其片段的重组质粒。所述内参质粒可为含有序列表的序列8所示的ABL基因片段的重组质粒。所述内参质粒具体可为将PMD18-T载体与序列表的序列8所示的ABL基因片段连接得到的重组质粒。所述特异性引物对甲和所述探针甲可用于制备辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。在多发性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，MAGE-A3基因表达，而在正常人的骨髓或外周血中，MAGE-A3基因不表达。且处于不同ISS期的多发性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，MAGE-A3基因的阳性率具有差异性。本专利技术的试剂盒，不仅可以应用于定性辅助诊断多发性骨髓瘤，还可以通过内参基因，测定患者MAGE-A3基因的表达水平。MAGE-A3基因的表达水平有希望 成为MM辅助诊断、预后和疗效监测指标，对其进行深入研究有助于了解MM的病理机制，寻求新的治疗策略。本专利技术为多发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本专利技术将在医学检测领域发挥重要作用。附图说明图1为内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线。图2为阳性对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线。图3为MAGE-A3基因表达量与浆细胞数和⑶38+/⑶138+浆细胞数的相关性结果。图4为MAGE-A3基因的表达量与患者生存时间的相关性结果。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。TRIzol kits 购自Invitrogen公司。RNAsin 购自华美生物技术公司。dNTP 购自Pharmecia公司。Mo-MLV逆转录酶、5 X标准缓冲液购自Promega公司。DNA连接酶 购自TakaRa公司。Universal PCR Master mix 购自天根生物技术有限公司。Phusion High-Fidelity PCR Kit:购自 New England Biolabs 公司。RPMI8226 细胞购自美国 ATCC (美国标准生物品收藏中心)，产品目录号为CCL-155。U266细胞购自美国ATCC，产品目录号为TIB-196。KG-I细胞购自中国科学院昆明细胞库，产品目录号为KCB 200552YJ。 HL60细胞购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu 23。Nalm-6细胞购自北京大学疾病基因研究中心。多发性骨髓瘤诊断及分期标准参照文献Greipp PR, San Miguel J, Durie BG, et al. International Staging System for Multiple Myeloma. Journal of Clinical Oncology，2005，15 :3412-3420.。疗效的评价标准参照文献Durie BG, Harousseau JL, Miguel JS, et al. International uniform response criteria for multiple myeloma. Leukemia. 2006，20 1467-1473.。统计分析应用SPSS软件v. 13. O。计量资料采用方差分析，计数资料采用卡方检验。临床资料与CT抗原基因表达间的相关性用直线相关分析。ρ < 0. 05被认为是有统计学意义。通过单因素和多因素分析评价因素与生存的相关性，采用 Log-rank检验鉴定生存相关因素，ρ < 0. 05的变量纳入Cox回归分析，ρ < 0. 2定义为与生存预后相关的因素。实施例3至9中的PCR参数均如下PCR反应体系(10 μ 1)上游引物0. 9 μ Μ，下游引物0. 9 μ Μ，探针0. 25 μ Μ, 2 X TaqMan通用PCR公共体系5 μ 1 (ABI公司，美国)，质粒1 ；其余为去离子水。PCR 反应条件50°C 2min, 1 个循环；95°C IOmin, 1 个循环；95°C 15s,60°C lmin, 50 个循环。实施例1、特异性引物对和探针的设计MAGE-A3基因(NCBI基因库序列号NM_005362)位于人染色体Xq28，针对MAGE-A3 基因的特异性引物对甲(由上游引物MAG-FP和下游引物MAG-RP组成，扩增产物为172bp) 和探针甲(探针MAG-T-probe)上游引物MAG-FP (序列表的序列 1) :5，-GGTGAGGAGGCAAGGTTCTGA-3，；下游引物MAG-RP (序列表的序列幻5，-GTGCTGACTCCTCTGCTCAAGAG-3，；探针MAG-T-probe (5，— 3，)本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种辅助诊断多发性骨髓瘤患者的试剂盒，包括特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列１所示ＤＮＡ和序列表的序列２所示ＤＮＡ组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列３所示。

【技术特征摘要】
1.一种辅助诊断多发性骨髓瘤患者的试剂盒，包括特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阳性质粒；所述阳性质粒为含有MAGE-A3基因或其片段的重组质粒。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述阳性质粒为含有序列表的序列7所示的MAGE-A3基因片段的重组质粒。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述阳性质粒为将PMD18-T载体与序列表的序列7所示的MAGE-A3基因片段连接得到的重组质粒。5.如权利要求1至4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括针对内参基因的特异性引物对乙和探针乙；所述内参基因为ABL基因。6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮国瑞，黄晓军，陈珊珊，刘开彦，江滨，刘艳荣，张瑶，
申请(专利权)人：北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：11