一种钾离子的荧光检测方法技术

本发明专利技术公开了一种钾离子的荧光检测方法。对钾离子特异性DNA(5’-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’)进行了有序切割加工，成为两段(5’-GGG?TTA?GGGTTA-3’和5’-FAM-TAA?GGG?ATT?GGG-3’)，其中一段的5’端标记了荧光素FAM。在没有钾离子存在时两段DNA链呈无规卷曲状态，容易快速吸附在纳米金的表面，荧光基团与纳米金表面靠近，荧光猝灭；加入钾离子后，两段DNA链形成G四链体结构，由于高的电荷密度和较为刚性的结构不能有效吸附在纳米金的表面，荧光基团与纳米金的距离增大，荧光增强。随钾离子浓度增加，荧光强度逐渐增强。本发明专利技术不仅具有高度的灵敏度，较好的特异性，而且操作简单。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及钾离子的检测领域，特别涉及。
技术介绍
钾离子(K+)作为一种重要的生理元素，与Na+共同作用，在维持细胞新陈代谢、调节体液渗透压、维持酸碱平衡及保存细胞应激功能等方面发挥着极其重要的作用，因此开发高灵敏度、高特异性的K+检测方法具有重要意义。目前， 钾离子检测方法很多，，但这些方法大多操作复杂，离子干扰大，或不适合水相体系。核酸适体(aptamer)是近年来发展起来的一类经体外人工合成筛选出的一段DNA 或RNA分子。由于对于某一种特定的目标分子，总能找到一种或多种与之特异结合的核酸适体，并且他们与目标靶分子具有高度的亲和力和特异性。因此核酸适体为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的高效快速识别的研究平台。相比抗体而言，核酸适体自身稳定性好、制备合成相对简单、快速、易获得、易功能化修饰与标记，且在生物传感器设计中应用灵活等优点，近几年在生物分析检测方面备受关注。目前已经成为临床诊断、环境监测、药学研究等许多领域中的研究热点。钾离子特异性 DNA(5，-GGG TTAGGG TTA GGG TTA GGG-3，)能够特异性与钾离子结合，在结合钾离子后能从无规卷曲结构变为G-四链体结构，而G-四链体结构具有重要的生物相关功能。近年来，基于核酸适体构象变化检测钾离子的方法已有文献报道。但这些方法有的需要对核酸适体进行双标记，有的需要共轭高分子，有的是荧光“关”型传感器。操作繁琐，价格昂贵，易受干扰， 限制了其在实际样品检测中的应用。3纳米金是一种优秀的光学探针。它具有高消光系数，颜色具有强烈的尺寸依赖性， 以其独特的光学性质和生物相容性在化学和生物检测中得到了广泛的应用。1998年Li等发现DNA单双链在纳米金表面的吸附能力不同，单链DNA为一柔性结构，暴露在外面的碱基可以通过Au-N相互作用使单链DNA吸附在纳米金表面，通过提高纳米金表面的电荷密度而有效的提高了纳米金在电解质中的稳定性。而双链DNA是刚性的，碱基被包在双螺旋内部因此无法与金发生相互作用，因此在提高电解质浓度后，纳米金就会发生聚集，宏观上呈现由红到蓝的颜色变化。因此，当纳米金分别与DNA单链或双链作用后，加入适当的盐会使得纳米金呈现不同的颜色。此种性质可用于DNA的相关检测、金属离子检测和其他物质分析。后来Wang 等发现G-四链体与双链DNA—样，由于高的电荷密度和较为刚性的结构不能有效吸附在纳米金的表面，加盐纳米金易聚集。Zhang 等对钾离子特异性 DNA (5，-GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG-3，)进行了有序的切割加工，使一段DNA链变成两个柔性单链片段DNA-I (5，-GGG TTA GGGTTA-3’)和DNA-2(5’-TAA GGG ATT GGG-3’)，由于DNA链的长度变短，不易形成分子内二级结构，而且不影响对配体的结合能力。加入钾离子后，两段可以通过配体结合反应重新结合成G-四链体结构，并且短链DNA在金表面的吸附动力学较快，纳米金可以有效区分加入靶前后的DNA结构，实现对靶的快速比色检测Khang J，Wang L H，Pan D, Song S P, Boey FY C，Zhang H, Fan C H. Small，2008，4 :1196-1200]。实验和理论均证明纳米金是一种高效猝灭剂，通过电子转移或能量转移几乎可以高效猝灭所有染料的荧光。纳米金的超猝灭性能已被用来检测DNA单碱基错配、蛋白质和汞离子。以汞离子检测为例，Wang 等将一标记有荧光染料的含有T-T错配碱基的单链DNA作为探针，在高的离子强度下，无Hg2+时， 单链DNA吸附到纳米金的表面，使得溶液的颜色从蓝灰色变为红色，同时染料靠近金表面荧光被猝灭；当有Hg2+存在时，由于形成T-Hg2+-T结构可使单链DNA形成准双链结构，不易吸附在纳米金表面，降低了裸金抵抗盐诱导团聚的能力，溶液颜色还为蓝灰色，但是由于荧光基团远离纳米金，荧光信号比无Hg2+要强。该传感器不需要对金纳米粒子作任何共价修饰，检测成本低；在水溶液中对Hg2+具有优异的灵敏度和特异性，检测限可达到4. OX 10_8M。 颜色变化显著并且是荧光“开”模式。
技术实现思路
本专利技术的目的是要解决现有技术的缺陷，利用纳米金的超猝灭性、核酸适体的构象变化和纳米金对单链DNA和G-四链体吸附性能的差异，提供一种高灵敏度和特异性，操作简单的荧光“开”型钾离子检测方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下(1)对钾离子特异性DNA进行了有序的切割加工，变成两段DNA-I和DNA-2，其中 DNA-2的5，端标记荧光素。将DNA-I和DNA-2等比例混合，取20 μ L与5 μ L待测金属阳离子或水或实际样品混合，室温孵育半个小时。(2)将10 μ L上述溶液加入到150 μ L纳米金溶液中，吸附5min后加入15 μ L磷酸盐缓冲溶液，加入150 μ L超纯水，测量其荧光发射光谱。本专利技术中所说的钾离子特异性DNA序列为5，-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3，。当体系中存在钾离子时，能够形成G四链体结构。本专利技术中所说的DNA-I禾Π DNA-2序列分别为5，-GGG TTA GGG TTA-3，， 5，-FAM-TAAGGG ATT GGG-3，。DNA_1、DNA_2与金属阳离子或水或实际样品混合后的终浓度均为4 μ M。本专利技术中所说的待测金属阳离子的浓度指的是DNA-1、DNA-2与金属阳离子混合后的浓度。本专利技术中所说的纳米金是指用柠檬酸钠还原氯金酸制备的，平均粒径13nm，浓度约 3· 5nM。本专利技术中所说的磷酸盐缓冲溶液是指IOmM PB，含0. 5M NaCl, pH8. 0。本专利技术中所说的待测金属阳离子为钾离子，锂离子，钙离子，镁离子，铵根离子，钠1 子。本专利技术的积极进步效果在于1、本专利技术只需两步即可完成，大大简化了操作步骤。一般工作者只需通过简单训练即可完成，无需专业工作人员进行操作。2、本专利技术40分钟之内即可完成检测。节约了检测时间。3、本专利技术是荧光“开”型传感器，克服了荧光“关”型传感器易受干扰的不足。4、本专利技术具有高度的灵敏度，检测限可达到3.9μΜ。附图说明图1为根据本专利技术的方法基于纳米金和核酸适体的钾离子检测示意图。图2为根据本专利技术的方法测定的不同钾离子浓度的荧光光谱(图2a)和线性动力学范围(图2b，c)。其中 = = 4 μ M，图加中钾离子浓度从下到上依次为0,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5，l，2，4，6，8，10，20，30，40，50mM。图 2b 和 c 为钾离子的两个线性动力学范围。图3为根据本专利技术的方法测定的不同金属离子的荧光光谱(图3a)和荧光强度 (图北)。其中，各种金属离子浓度为20mM。具体实施例方式下面根据附图，给出本专利技术优选的实施例，并予以详细的描述，使能更好地理解本专利技术的功能、特点。实验仪器所用仪器为荧光分光光度计(LS-55，美国Perkins Elmer仪器有限公司)，仪器测定条件为脉冲式氙灯激发，激发波长为480nm，荧光光谱的扫描范围490-620nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm，用宽度IOmm石英比色皿进行测量，样品体积2mL ；室温。作为本本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种钾离子的荧光检测方法，其包括下列步骤：（１）对钾离子特异性ＤＮＡ进行了有序的切割加工，变成两段ＤＮＡ－１和ＤＮＡ－２，其中ＤＮＡ－２的５’端标记荧光素，将ＤＮＡ－１和ＤＮＡ－２等比例混合，取２０μＬ与５μＬ待测金属阳离子或水或实际样品混合，室温孵育半个小时。（２）将１０μＬ上述溶液加入到１５０μＬ纳米金溶液中，吸附５ｍｉｎ后加入１５μＬ磷酸盐缓冲溶液，加入１５０μＬ超纯水，测量其荧光发射光谱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐慧，高淑丽，徐平平，柳全文，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：37