一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，包括如下工艺：以含肝素3-10IU/ml的注射用水作为肝素钠溶液溶解冷沉淀，经PEG沉淀后取上清液，离心过滤，24-26℃S/D灭活，DEAESepharoseFastFlow层析柱平衡、吸附、洗涤、洗脱，分子膜超滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，99.5-100.5℃干热灭活。本发明专利技术采用PEG沉淀和离子交换层析技术相结合的工艺方法，操作简便，既提高FⅧ活性回收率，又可大量去除杂蛋白，产品收率达到60%以上，产品比活达到5IU/mg，明显高于药典不少于1IU/mg的规定。同时，PEG残留为0.08g/L，明显低于药典≤0.5g/L规定，避免了Al（OH）3凝胶法最终制剂中Al3+残留，产品纯度高、安全性好，最终制品质量得到明显改善。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种冻干人凝血因子VDI的制备方法。
技术介绍
凝血因子VDI(简称F VID制剂与白蛋白制剂、免疫球蛋白制剂在国外同为血浆蛋白制剂的三大支柱产品，F VDI制剂是临床用于甲型血友病患者出血症替补治疗的特效制剂，由于该病至今无根治之术，病人一生都需要输注F VDI制剂，因此国内外市场需求量较大，为了避免潜在的血液来源的病毒传染，出于安全考虑，目前我国禁止进口凝血因子类血液制品。 目前国内具备人凝血因子VDI的生产厂家只有上海莱仕、华兰生物等少数几家具有人凝血因子VDI的生产批文。现有生产工艺生产人凝血因子VDI比活、产品得率及成功率较低，面对国内人凝血因子VDI的短缺，现阶段研发生产安全性高、产品纯度高、产品比活性好的人凝血因子 VDI具有积极意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的上述不足，而提供一种安全性高、产品纯度高、工艺简单、产品比活性好的冻干人凝血因子VDI的制备方法。本专利技术的技术方案是一种冻干人凝血因子VDI的制备方法，包括如下工艺以含肝素3-10IU/ml的注射用水作为肝素钠溶液溶解冷沉淀，经PEG沉淀后取上清液，离心过滤，2446°C S/D灭活，DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡、吸附、洗涤、洗脱，分子膜超滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，99. 5-100. 5°C干热灭活；PEG沉淀时，在冷沉淀溶解后的上清液中加入PEG至溶液中PEG终浓度为2. 5-4. 5%。DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡时，用平衡液平衡层析柱至流出液pH值为 6. 5-7. 5，平衡液中含 80-115mmol/LNaCl、15-25mmol/L柠檬酸钠、1. 0-4. 0%甘氨酸和 / 或盐酸精氨酸、1. 5-2. 5mmol/L CaCl2, pH值6. 5-7. 5，其余为注射用水。洗涤时，用1-2倍柱体积洗涤液洗涤层析柱8次以上，洗涤液中含115-135mmol/ LNaCl、15-25mmol/L 柠檬酸钠、1. 0-3. 0% 甘氨酸和 / 或盐酸精氨酸、1. 5-2. 5mmol/L CaCl2, pH值6. 5-7. 5，其余为注射用水。洗脱时，用1-2倍柱体积洗脱液洗脱2次，洗脱液中含SOO-lOOOmmol/LNaCl、 20-40mmol/L柠檬酸钠、1.0-3. 0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、2-4mmol/L CaCl2, pH值 6. 5-7. 5，其余为注射用水。超滤时，用十万分子量膜的超滤器超滤预浓缩至洗脱液一半，然后用透析液对半超滤至浓缩液电导率u ^ 15ms/cm，透析液中含10-15mmol/L柠檬酸钠、1. 0-3. 0%甘氨酸和 /或盐酸精氨酸、1-1. 5mmol/L CaCl2, pH值6. 5-7. 5，其余为注射用水。洗脱后的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱可再生后使用，其方法是先用1_2 倍柱体积1. 0-1. 5mol/LNaCl再生液洗涤DEAE Sepharose Fast Flow层析柱2_4次，其次用1-2倍柱体积注射用水洗涤2-4次，再用3-4个柱体积0. 5mol/LNa0H洗涤层析柱，然后用2-3个柱体积0. 2mol/LNa0H洗涤层析柱，最后用0. 2mol/LNa0H保存。本专利技术所提出的上述用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱对F VP及附分离方法， 可以适用于任何一种常规方法，包括普通柱层析方法和搅拌柱层析方法。本专利技术所用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱还可以是DEAE 650M凝胶层析柱或DEAE S印haroseTSK650M凝胶层析柱。本专利技术采用PEG沉淀和离子交换层析技术相结合，在第一步F VDI粗提过程中，本专利技术选用肝素溶液作为溶解液，取代常用的Tris-HCl溶液，在制备过程中有效的减少了 F VDI C活性的损失，使F VDI :C活性提高30%以上，比活提高3倍，并且澄明度也好。试验结果见表"~~'ο表1肝素钠溶解液与Tirs-HCl溶解液抽提后PEG上清F VDI活性、比活的比较 (Xn=8)权利要求1.一种冻干人凝血因子VDI的制备方法，包括如下工艺以含肝素3-10IU/ml的注射用水作为肝素钠溶液溶解冷沉淀，经PEG沉淀后取上清液，离心过滤，24-260C S/D灭活，DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡、吸附、洗涤、洗脱，分子膜超滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，99. 5-100. 5°C干热灭活；其特征是PEG沉淀时，在冷沉淀溶解后的上清液中加入PEG至溶液中PEG终浓度为2. 5-4. 5%。2.根据权利要求1所述的冻干人凝血因子VDI的制备方法，其特征是DEAESepharose Fast Flow层析柱平衡时，用平衡液平衡层析柱至流出液pH值为6. 5-7. 5，平衡液中含80-115mmol/LNaCl、15-25mmol/L柠檬酸钠、1.0-4. 0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、 1. 5-2. 5mmol/L CaCl2, pH 值 6. 5-7. 5，其余为注射用水。3.根据权利要求1所述的冻干人凝血因子VDI的制备方法，其特征是洗涤时，用1-2倍柱体积洗涤液洗涤层析柱8次以上，洗涤液中含115-135mm0l/LNaCl、15-25mm0l/L柠檬酸钠、1. 0-3. 0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、1. 5-2. 5mmol/L CaCl2, pH值6. 5-7. 5，其余为注射用水。4.根据权利要求1所述的冻干人凝血因子VDI的制备方法，其特征是洗脱时，用1-2倍柱体积洗脱液洗脱2次，洗脱液中含800-1000mmOl/LNaCl、20-40mmOl/L柠檬酸钠、1. 0-3. 0% 甘氨酸和/或盐酸精氨酸、2-4mmol/L CaCl2, pH值6. 5-7. 5，其余为注射用水。5.根据权利要求1所述的冻干人凝血因子VDI的制备方法，其特征是超滤时，用十万分子量膜的超滤器超滤预浓缩至洗脱液一半，然后用透析液对半超滤至浓缩液电导率 u ^ 151^/011，透析液中含10-15讓01/1柠檬酸钠、1.0-3.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、 1-1. 5mmol/L CaCl2, pH 值 6. 5-7. 5，其余为注射用水。6.根据权利要求1所述的冻干人凝血因子VDI的制备方法，其特征是洗脱后的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱可再生后使用，其方法是先用1_2倍柱体积1. 0-1. 5mol/ LNaCl再生液洗涤DEAE Sepharose Fast Flow层析柱2_4次，其次用1_2倍柱体积注射用水洗涤2-4次，再用3-4个柱体积0. 5mol/LNa0H洗涤层析柱，然后用2_3个柱体积0. 2mol/ LNaOH洗涤层析柱，最后用0. 2mol/LNaOH保存。7.根据权利要求1-6所述的冻干人凝血因子VDI的制备方法，其特征是用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱对F VP及附分离方法，可以适用于任何一种常规方法，包括普通柱层析方法和搅拌柱层析方法。8.根据本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，包括如下工艺：以含肝素３－１０ＩＵ／ｍｌ的注射用水作为肝素钠溶液溶解冷沉淀，经ＰＥＧ沉淀后取上清液，离心过滤，２４－２６℃Ｓ／Ｄ灭活，ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ层析柱平衡、吸附、洗涤、洗脱，分子膜超滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，９９．５－１００．５℃干热灭活；其特征是ＰＥＧ沉淀时，在冷沉淀溶解后的上清液中加入ＰＥＧ至溶液中ＰＥＧ终浓度为２．５－４．５％。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：岳跃飞，单永红，资道凤，
申请(专利权)人：湖南紫光古汉南岳制药有限公司，
类型：发明
国别省市：43
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