一种EV71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种EV71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗，所述EV71病毒样颗粒按照以下步骤制备：(1)重组质粒的构建：用肠道病毒EV71的P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZαA质粒分别连接后构建P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株：所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMD1168表达菌株，得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化：培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒。本发明专利技术的EV71病毒样颗粒易于通过菌体培养获得，稳定性好、易于纯化，适于制备疫苗，且便于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种EV71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗。
技术介绍
自1957年以来，手足口病在世界多个国家爆发流行，特别是20世纪90年代以来， 在亚太地区流行日益猖獗。2007年以来中国大陆发生手足口病爆发流行，至2010年9月底，累计报告300多万儿童感染手足口病，严重威胁儿童的身体健康和生命安全。手足口病的病原体主要是小RNA病毒，肠道病毒属成员，主要是柯萨奇A组16型(Coxsakie A16， CoxA16)和肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)，其中EV71病毒是导致神经系统并发症和死亡病例的主要病原体。目前还没有有效的疫苗用以预防EV71，但脊髓灰质炎疫苗在控制全球脊髓灰质炎病毒传播中的成功实践，给EV71疫苗的研制带来了希望。不同形式的EV71疫苗都处于研发阶段，研究发现福尔马林灭活的EV71疫苗产生的中和抗体(1 64)比自然感染的中和抗体(1 128)低，可能是因为福尔马林灭活的EV71疫苗在制备过程中破坏了 B细胞表位。 研究也发现热灭活的全病毒疫苗诱导的中和抗体滴度比自然感染明显低，可能也与破坏构象表位有关；并且灭活疫苗存在灭活不完全的风险。减毒活疫苗可以保存构象表位，但也存在毒力回复的风险。病毒样颗粒(Virus Like Particle，VLP)疫苗的发展为如何研发既保持构象表位并且无毒力回复风险的疫苗提供了一种新的研究策略。VLP疫苗是通过分子生物学技术，表达病毒的一个或多个结构蛋白，这些结构蛋白具有天然的自装配能力，可形成与真正病毒颗粒相同或相似的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，没有感染性，不存在灭活不完全或毒力回复的风险，并且表面有高密度的病毒抗原，保存了构象表位，可通过和全病毒疫苗一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。目前国内外有多家研究组进行EV71病毒颗粒疫苗的研制，发表的文献(Chung YC, Huang JH, Lai Cff, et al. Expression, purification and characterization of enterovirus-71 virus-like particles. World J Gastroenterol 2006 ;12 :921-927 ；)主要用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达EV71的3⑶和Pl蛋白，3⑶蛋白酶能将Pl 前蛋白酶切为VP1，VP3和VPO三个蛋白，这三个蛋白能自动组装成VLPs，能诱导产生Thl 和Th2免疫反应。用VLPs免疫的母鼠能给用EV71病毒致死攻击的乳鼠提供免疫保护，表明EV71VLPS是一种有效的疫苗。但是，由于目前主要用昆虫细胞制备VLPs，培养条件要求较高；又由于是胞内表达，VLP纯化过程复杂，限制了大规模的生产需求；而且杆状病毒-昆虫细胞系统另一个主要的缺陷是产生杆状病毒颗粒及其他明显影响疫苗效果的污染物，由于杆状病毒颗粒很难和制备的VLP分离开来，制备的VLP应用于临床需要进行化学灭活处理等措施，这些处理可能会影响制备的VLP的质量。
技术实现思路
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种从新的表达系统获得的EV71病毒样颗粒，该EV71病毒样颗粒易于培养获得，适合工业化生产，且便于纯化。本专利技术的另一目的是提供以上述EV71病毒样颗粒制备的手足口病疫苗。本专利技术提供的一种EV71病毒样颗粒，其中，所述EV71病毒样颗粒的制备过程包括(1)重组质粒的构建用EV71病毒的Pl蛋白基因和3⑶蛋白酶基因与pGAPZaA质粒分别连接后构建Pl-pGAPZ a A和3⑶-pGAPZ a A重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMDl 168表达菌株，得到Pl-pGAPZ a A_3CD_pGAPZ a A-SMDl 168 毕赤酵母重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71 病毒样颗粒。本专利技术通过构建并培养能够表达EV71病毒样颗粒的毕赤酵母重组表达菌株，成功的获得了一种易于通过菌体培养获得，适合工业化生产，且便于纯化的EV71病毒样颗粒。进一步，所述Pl-pGAPZ a A重组质粒是将Pl蛋白基因与pGAPZaA质粒均用RiilI 内切酶和^iclI内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将Pl基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。 进一步，所述3⑶-pGAPZ a A重组质粒是将所述3⑶蛋白酶基因和pGAPZaA质粒均用EcoRI和^CbaI内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将3⑶蛋白酶基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。进一步，所述3⑶蛋白酶基因和Pl蛋白基因是以EV71病毒RNA反转录的cDNA为模板，用PCR方法扩增获得。进一步，所述重组质粒转入表达菌株是用电穿孔仪先将所述3⑶-pGAPZaA质粒转入SMDl 168酵母表达菌株，用低浓度博莱霉素zeocin筛选得到3⑶-pGAPZ α A-SMD1168 重组表达菌株，然后再将所述Pl-pGAPZ α A质粒转入3⑶-pGAPZ α A-SMDl 168重组表达菌株，用高浓度博莱霉素zeocin筛选得到Pl-pGAPZ α A_3CD_pGAPZ α A-SMDl 168重组表达菌株。进一步，所述低浓度博莱霉素zeocin是指100 μ g/ml浓度的博莱霉素，所述高浓度zeocin是指500 μ g/ml浓度的博莱霉素。进一步，所述EV71病毒样颗粒纯化是将所述毕赤酵母重组表达菌株培养菌液 5000转/分钟转速离心10分钟，取上清，超速离心28000转/分钟转速离心4小时，弃上清， 沉淀用磷酸盐缓冲液PBS溶解，铺于不连续重量百分比蔗糖梯度15^^30^^45%和60% 上，于28000转/分钟4°C离心1小时，收集15% -30%层病毒带，用磷酸缓冲液稀释，28000 转/分钟4°C离心2. 5小时，弃去上清液，即得纯化的EV71病毒样颗粒。本专利技术提供的一种手足口病疫苗，所述疫苗的制备方法包括(1)重组质粒的构建用EV71病毒Pl蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZaA质粒分别连接后构建 Pl-pGAPZ α A和3⑶-pGAPZ α A重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMD1168表达菌株，得到Pl-pGAPZ α A_3CD_pGAPZ α A-SMDl 168重组表达菌株；C3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒；(4)制备疫苗所述EV71病毒样颗粒用磷酸缓冲液溶解到40 μ g/ml，与等体积弗氏完全佐剂相混合制成疫苗。本专利技术的有益效果在于1.表达本专利技术EV71病毒样颗粒的毕赤酵母重组表达菌株易于筛选得到重组转化子具有kocin抗性标记基因，可直接用kocin进行筛选，大大简化了重组转化酵母的筛选过程。2.本专利技术的EV71病毒样颗粒适于制备疫苗本专利技术选择的毕赤酵母重组表达菌株具有真本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种ＥＶ７１病毒样颗粒，其特征在于，所述ＥＶ７１病毒样颗粒的制备方法包括：（１）重组质粒的构建：用ＥＶ７１病毒的Ｐ１蛋白基因和３ＣＤ蛋白酶基因与ｐＧＡＰＺαＡ质粒分别连接后构建Ｐ１－ｐＧＡＰＺαＡ和３ＣＤ－ｐＧＡＰＺαＡ重组质粒；（２）重组质粒转入表达菌株：所述重组质粒依次转入毕赤酵母ＳＭＤ１１６８表达菌株，得到Ｐ１－ｐＧＡＰＺαＡ－３ＣＤ－ｐＧＡＰＺαＡ－ＳＭＤ１１６８毕赤酵母重组表达菌株；（３）菌体培养及ＥＶ７１病毒样颗粒纯化：培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得ＥＶ７１病毒样颗粒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张定梅，陆家海，曹开源，黎孟枫，
申请(专利权)人：张定梅，陆家海，曹开源，黎孟枫，
类型：发明
国别省市：81