本发明专利技术涉及一种尘螨变应原浸液制备中的病毒去除和灭活处理工艺。通过一种或多种方法联合去除／灭活病毒。具体的说包括１）干热法：提取过程中所用仪器３００℃干烤，培养基及提取用缓冲液８０℃加热７２小时，病毒灭活用的干热箱至少每半年验证一次。所有操作过程均为严格无菌操作。２）过滤法：用滤膜过滤变应原提取液去除分子量大于１００ｋＤａ的病毒。３）超声法：将除菌过滤前或除菌分装后的提取液通过可暴露于微波能量的单一环路通道灭活病毒。４）色谱法：用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ－１００分子筛除去分子量大于１００ｋＤａ的病毒。５）对所有去除和灭活病毒方法均进行验证。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及变应原提取制备工艺，具体地说是一种尘螨变应原浸液制备中的病毒去除灭活处理工艺。
技术介绍
近50年变应患病率在全球急剧上升，估计全球40％以上的人群是具特应性(atopy)。哮喘在儿童中患病率为10％～15％，全球有1.0～1.5亿患儿，是西方国家儿童慢性病住院医治的主要病种，许多国家为此支付巨大的卫生经费。1997年《欧洲变应白皮书》指出21世纪变应流行，预防日益上升的变应/哮喘的患病率，2000年成立了世界变应组织(World Allergy Organization。WAO)，负责变态反应学的交流和教育，研讨防治策略。尘螨是螨性变应(mite allergy)是上世纪60年代变应学的一项突破，公认为世界性卫生问题。屋尘中的住家螨类广泛分布于全球有人群生活的地方，是强烈的变应原，引起的是全身性变态反应(allergy)，包括变应性哮喘、变应性鼻球结膜炎、特应性湿疹/皮炎、变应性荨麻疹等，螨性变应相应占各该病种的80％左右。2003年全球哮喘防治策略(GINA)委员会提出全球哮喘病人估计有3亿，2000年我国儿童哮喘患病率为0.5-3％，初步估计中国有1000万左右的哮喘儿童，全国共有2500万左右的哮喘病人，而2000年国内在27城市调查儿童哮喘患病率较1990年上升70％左右。有的大城市则上升了一倍还多。这与大气污染及生活模式不断西化有关，随着居住条件的改善，人们在密封空调室内工作、生活和学习时间越来越多，因而室内过敏原成了主要的致敏因素。关于螨作为哮喘的变应原问题，德国Dekker在1928年已提出，至1964年才为荷兰Voorhorst等证实屋尘螨的代谢产物是屋尘中的主要变应原，以屋尘螨疫苗对患者进行免疫治疗有良好疗效，现在研究已进入分子水平。我国从上世纪七十年代初上海医科大学医学螨类研究室开始了尘螨变应的系列研究，进行了大量基础和应用的调查研究，研制并生产粉尘螨疫苗供诊断和免疫治疗螨性变态反应具特效，取得了显著的成绩。″变应原″的制备和应用必须符合安全、有效、可控的原则。目前制备变应原浸液中的病毒灭活工艺还未受到重视。鉴于病毒对人体的危害，根据国家对生物制剂制定的有关安全法规，有必要在此过程中引进病毒去除和灭活处理工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提高尘螨变应原浸液的安全性。为临床治疗提供安全、可靠的变应原疫苗。本专利技术采用了一种或多种方法联合去除/灭活病毒。(1)干热法灭活病毒 提取过程中所用仪器300℃干烤24小时。培养基和提取缓冲溶液80℃加热72小时，病毒灭活用的干热箱至少每半年验证一次。所有操作过程均为严格无菌操作。(2)用滤膜过滤变应原提取液与常规分离方法比，膜分离工艺有分离迅速、节约能源、提高收率、减少污染、设备简单、连续操作等优点。应考虑到提取液中变应原蛋白质及多肽的分子量选择适当的滤膜系统，在过滤前对所选滤膜的病毒清除有效性和滤膜完整性进行检测。(3)微波灭活病毒微波可以灭活有机体，对细菌、放线菌、真菌、噬菌体以及病毒等均有不同程度的灭活效果，且具有作用速度快、不残留有害物等特点。(4)色谱法去除病毒色谱法根据蛋白质产物理化性质的不同进行设计及优化从而达到分离杂蛋白及去除病毒等污染物。采用减小规模的色谱柱装置对色谱过程的各个参数进行检测。任何情况下，用于平衡、分离再生的缓冲液需与生产过程中使用的缓冲液相同。(5)去除与灭活效果的验证去除与灭活病毒效果的验证在确保生物技术制品安全性方面起重要作用。对清除与灭活病毒效果的验证和评估有助于对任何未知、未发觉和有害病毒的去除提供一个可信的安全参考值。其目的是对灭活及去除病毒过程中定量估计病毒减少总水平方面有效的生产工序；验证过程始于原材料及不同生产阶段的不同组分中添加有效量的某一病毒，并证明随后的生产工序将其去除或灭活。验证中应注意的其他事项有①应选择与生产过程中采用的原材料可能含有病毒种类的相关病毒或与其密切相关的特异模型病毒。所选病毒的理化性质应有代表性(病毒大小、核酸类型以及有无包膜等)，其中至少应包含有一种对物理或化学处理有明显抗性的病毒。②应研究影响去除/灭活病毒效果的参数(包括机械参数和理化参数)允许变化的幅度。③研究病毒灭活动力学，包括病毒灭活速率和灭活曲线。④指示病毒滴度应该尽可能高(病毒滴度应≥106/ml)。⑤加入的病毒与待验证样品体积比不能高于1∶9。⑥如可能，验证过程中每步取出的样品应尽快直接进行病毒滴定，不做进一步处理(如超离心、透析或保存、除去抑制剂或毒性物质等)。如果样品必须做进一步处理，或不同时间取出的样品要在同一时间进行测定，应考虑这些处理方法对病毒检测结果的影响。⑦检测方法可包括蚀斑形成、细胞病变(如合胞体或病灶形成)、终点滴定或其他方法。这些方法应该有适宜的灵敏度和可重复性，每一个取样点应取双份样品并设有对照以保证结果的准确性。⑧分别对各种病毒去除/灭活方法进行病毒灭活效果验证。具体实施例方式本专利技术的内容，通过以下的实施例作具体说明实施例1尘螨变应原浸液的制备收集屋尘螨，称量去脂材料，按1∶5比例(1g屋尘加入5ml提取液)加入碳酸氢钠-盐水提取液，提取72小时。每天在振荡器上振荡2小时，其余时间放入冰箱提取。提取完成后，先用多层纱布过滤，弃去沉淀物，再用布氏漏斗加多层滤纸减压过滤，澄清液体。记录滤液量，放入透囊中透析24小时。使用碳酸氢钠-盐水提取液作为透析用液，每6小时更换一次。透析完毕，再称量滤液，如因盐析作用多出原量或少于原量，进行浓缩或稀释，使之保持原量。校正溶液pH值，使之保持在7。在严格无菌操作下，将消毒蔡氏滤器安装于消毒滤瓶上，用蒸馏水打湿滤板，倒入屋尘溶液。15分钟后接通真空泵，使滤液穿过滤材滴入滤瓶，于无菌下分装于瓶中。贴好标签，打上批号，放入4-6℃冰箱储备待用。实施例2干热法灭活病毒提取过程中所用仪器300℃干烤24小时，培养基及提取缓冲液80℃加热72小时，病毒灭活用的干热箱至少每半年验证一次。验证时干燥箱内应设多个测温点(包括制品内、箱内最高和最低温度点)。所有操作过程均为严格无菌操作。实施例3过滤去除病毒在过滤前及过滤后应测试滤膜的完整性。每次过滤均需采用新的滤膜。由于提取液中的变应原蛋白质和多肽分子量小于100kDa，故选用Millipore公司生产的ViresolveTM复合膜或Asahi公司生产的PLANOVA过滤分子量大于100kDa的病毒。实施例4微波灭活病毒将除菌过滤前或除菌分装后的提取液流经一个可暴露于微波能量的一次性使用的单一环路通道，并在生产过程中相同的条件下暴露于微波，流速1ms，同时保持能量恒定，从而决定了温度峰值不高于40℃。实施例5色谱去除病毒将产物溶液通过Sephadex S-100分子筛，平衡、上样和洗脱缓冲液均采用0.02M-PBS缓冲液，流速0.5ml/min。实施例6去除与灭活病毒效果的验证在单独的有病毒工作设备的实验室内进行，并由有病毒工作经验的人员和设计制定按比例缩小纯化工艺的生产人员共同完成。将病毒SV40(滴度2×106/ml)加入到要测试的每一生产步骤正在加工的材料中去(体积比不超过1∶9)，于不同时间取双份样品(一份对照)，并绘制灭活曲线；或进行相应的对照试验证实病毒的感染性经处理而失本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种尘螨变应原制备的病毒去除和灭活处理工艺，具体地说是通过一种和多种方法对尘螨变应原提取过程中的病毒去除和灭活处理工艺。１）干热法：提取过程中所用仪器３００℃干烤，培养基及提取用缓冲液８０℃加热７２小时，病毒灭活用的干热箱至少每半年验证一次。所有操作过程均为严格无菌操作。２）过滤法：用滤膜过滤变应原提取液去除分子量大于１００ｋＤａ的病毒。３）超声法：将除菌过滤前或除菌分装后的提取液通过可暴露于微波能量的单一环路通道灭活病毒。４）色谱法：用ＳｅｐｈａｄｅｘＳ－１００分子筛除 去分子量大于１００ｋＤａ的病毒。５）对所有去除和灭活病毒方法均进行验证。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘志刚，吉坤美，喻海琼，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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