P150SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体及其制备方法技术

本发明专利技术是一种P150SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体及其制备方法。载体命名为p150Sal2-Luciferase表达载体，其中p150Sal2-luciferase片段全长2278bp，其中32～2313之间为p150Sal2promoter，2348～4000为luciferase阅读框。制备方法包括：设计引物，目的片段的克隆，扩增产物纯化，制备p150Sal2启动子荧光素酶真核表达载体。本发明专利技术能够有效、准确、灵敏、方便和快捷发现具有肿瘤抑制潜力的化合物。

【技术实现步骤摘要】
P150SAL2启动子-荧光素酶真核表达载体及其制备方法本专利技术涉及一种药物
的载体及其制备方法，具体是一种P15012启动子-荧光素酶真核表达载体及其制备方法。
技术介绍
pl50Sa12属于遗传与胚胎发育相关的多锌指同源异型转录因子(multi-zinc finger homeotic transcription factor)，属于一组在哺乳动物中与果蝇Spalt直向同源 (orthologs)的Sal蛋白，在遗传发育中起重要作用。在果蝇中，Spalt决定特定胚胎区域的细胞命运。Spalt在进化中非常保守，在线虫，斑马鱼，蟾蜍，鸡，小鼠和人中都发现有其直向同源的Sal基因。在人类遗传中，这组同源基因又被称作MlL(Sal-Like)基因，目前共有&ilLl-&ilL4四个功能基因，pl50Sa12又称&ilL2。其中SalLl和SalL4基因突变都会造成人类遗传性发育缺陷，基因敲除小鼠也有发育缺陷。但现有的&12基因敲除小鼠没有明显的发育缺陷，这可能是基因敲除不完全的原因，也可能是Sal2在进化中获得了发育以外的功能，包括抑制肿瘤形成的功能。但pl50Sa12同时可能是新的抑癌基因。人类多瘤病毒SV40T抗原靶向结合宿主抑癌蛋白使之失活，从而避免细胞过早凋亡并促进细胞分裂，以利病毒复制。我们发现多锌指转录因子pl50Sal2(Sa12，Sall2)是多瘤病毒T抗原的结合靶蛋白，也是宿主细胞抑制病毒复制与肿瘤生成的重要调节蛋白。小鼠多瘤病毒(murine polyomavirus)是与SV40，HPV同类的小型DNA致肿瘤病毒。DNA肿瘤病毒(DNA Tumor Virus)的致癌蛋白的功能在于依靠靶向结合与修饰来改变宿主靶点蛋白的功能与活性。这些宿主的靶点蛋白通常在调节细胞的复制和生存过程中起着关键的作用，其中包括许多著名的肿瘤抑制基因(如Rb，p53)和前癌基因(如c-src)。自发肿瘤形成过程中的基因突变与细胞代谢改变常常与病毒诱发肿瘤的基因改变与代谢改变十分相似，例如抑癌基因P53突变也是自发肿瘤的重要原因之一，并且p53就是首先作为SV40大T抗原的结合靶蛋白被发现的。多瘤病毒大T抗原靶向结合并灭活pl50Sa12的功能是我们通过在肿瘤细胞与正常细胞中宿主范围对比筛选宿主蛋白结合缺陷型病毒发现的[8]。由此选出的失去P150Sa12结合功能的缺陷型病毒不能在正常宿主细胞中复制并产生肿瘤，却可以在“2调节通道缺陷的肿瘤细胞中生长复制。由于Sal2在多瘤病毒侵染传播途径中的重要组织肺和肾中都有大量的表达，因而多瘤病毒有可能在进化中发展出对％2靶向灭活的功能以利病毒在这些组织中的复制并造成肿瘤。pl50Sa12的下游靶基因是揭示Sal2抑癌调控机制的重要环节。在某些情况下独立激活P53的靶基因p21的转录后，目前我们在研究中也发现Sal2对抑癌基因pl6INMa的表达有诱导作用。这些下游靶基因的发现使得Pl50sa12成为了相关信号通路上一个至关重要的节点基因，因此我们准备将其作为药物筛选的一个靶标。基于靶标的筛选应用比较广泛，作为药物筛选靶标的可以是某种酶，细胞表面或细胞内某种受体等，这类方法的靶标唯一，而以启动子作为筛选靶标，建立启动子-报告基因系统来表征启动子活性强弱，由于启动子的活性受多种因子影响，所以可扩大筛选范围提高筛选效率，Pl50sa12基因作为细胞信号网络中的节点基因，在许多肿瘤细胞中表达异常，其启动子的活性直接影响该基因的表达量。 因此，我们构建Pl50sa12启动子与荧光素酶作为报告基因的重组质粒，可以通过瞬时转染肿瘤细胞的方式，体外加入化合物，测量化合物对于荧光素酶的影响，从而间接反映检测化合物对于pl50Sa12的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种P150i2启动子-荧光素酶真核表达载体及其制备方法。本专利技术能够有效、准确、灵敏、方便和快捷发现具有肿瘤抑制潜力的化合物。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术涉及一种Ρ150Μ 2启动子-荧光素酶真核表达载体，命名为 pl50Sal2-luciferase 表达载体，其中 pl50Sal2_luciferase 片段全长 2278bp，其中 32 2313 之间为 pl50Sal2promoter,2348 4000 为 Iuciferase 阅读框。本专利技术还涉及这种Ρ150Μ 2启动子-荧光素酶真核表达载体的制备方法，包括如下步骤A、设计引物根据pl50Sa12启动子序列设计引物，引物序列如下Fl 5’ CGCCATGGAAGCTTGTGGGGGAAGTGGAGGGCCAGGTGG-3’Rl :5’ GGCCATGGCTCGAGGTGGTTTCAGCTCCCCCACCCACTG-3，B、目的片段的克隆以 NHF (Normal Human Foreskin Fibroblast)细胞 DNA 为模板，巢氏进行PCR梯度扩增C、扩增产物纯化PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约2. 4kb的扩增条带，将目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化；D、制备pl50Sa12启动子荧光素酶(Iuciferase)真核表达载体D-1、PCR 产物、PGL3 载体 Xhol+Hindlll 双酶切，纯化；D-2、连接回收的pl50Sa12启动子的片段和线性的载体用T4连接酶进行体外连接反应；D-3、转化大肠杆菌将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素 100 μ 1-ml的LB培养基上37°C培养12-16小时；D-4、将茵落放大培养，纯化提取质粒；D-5、利用PvuII+Hindlll双酶切，挑取片段为1. 9Kb+5. Ikb的克隆，为插入Pl50sa12启动子的重组质粒，测序。步骤A中所述的设计引物从人类NHF (Normal Human Foreskin Fibroblast)细胞 DNA中通过PCR的方法用Taq酶克隆得到pl50Sa12启动子，然后经过Biol+Hindlll双酶切将启动子切为粘性末端，插入PGL3真核表达载体，构建重组的pl50Sal2-lUciferase真核表达载体。步骤B中所述的进行PCR梯度扩增是指采用热启动两步法进行PCR和采用热启动两步法进行PCR，其中采用热启动两步法进行PCR VX NHF (Normal Human Foreskin Fibroblast) DNA (0. 7 μ g-μ L)力牛莫片反，±游引物为Fl下游引物为R1，进行PCR，其中PCR 反应体系(50 μ L)模板 HOSE DNAl μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 1 μ 1， 2XGC-rich PCRbuffer 22. 5 μ 1，dNTP (2. 5mM) 4 μ 1，ddH2015. 5 μ 1，Taq 聚合酶 (5U- μ L) 1 μ 10PCR 反应条件:98°C变性，5min ；加入 Taq 酶；95°C变性，5min ；1 循环；94°C，lmin ； 梯度温度(55 70°C ) °C,5min ；35循环；72°C延伸lOmin，1循环；10°C，H本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种Ｐ１５０ＳＡＬ２启动子－荧光素酶真核表达载体，其特征在于：命名为ｐ１５０Ｓａｌ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ表达载体，其中ｐ１５０Ｓａｌ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ片段全长２２７８ｂｐ，其中３２～２３１３之间为ｐ１５０Ｓａｌ２ｐｒｏｍｏｔｅｒ，２３４８～４０００为ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ阅读框。

【技术特征摘要】
1.一种Ρ150Μ 2启动子-荧光素酶真核表达载体，其特征在于命名为 pl50Sal2-luciferase 表达载体，其中 pl50Sal2_luciferase 片段全长 2278bp，其中 32 2313 之间为 pl50Sal2promoter,2348 4000 为 Iuciferase 阅读框。2.—种Ρ150Μ 2启动子-荧光素酶真核表达载体的制备方法，其特征是，包括如下步骤A、设计引物根据pl50Sa12启动子序列设计引物，引物序列如下 Fl :5’ CGCCATGGAAGCTTGTGGGGGAAGTGGAGGGCCAGGTGG-3’Rl 5' GGCCATGGCTCGAGGTGGTTTCAGCTCCCCCACCCACTG-3，B、目的片段的克隆以NHF细胞DNA为模板，巢氏进行PCR梯度扩增C、扩增产物纯化PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约2.4kb的扩增条带，将目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化；D、制备pl50Sa12启动子荧光素酶真核表达载体 D-1、PCR产物、PGL3载体Xhol+Hindlll双酶切，纯化；D-2、连接回收的pl50Sa12启动子的片段和线性的载体用T4连接酶进行体外连接反应；D-3、转化大肠杆菌将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素 100 μ 1-ml的LB培养基上37°C培养12-16小时； D-4、将茵落放大培养，纯化提取质粒；D-5、利用PvuII+HindHI双酶切，挑取片段为1. 9Kb+5. Ikb的克隆，为插入pl50Sa12启动子的重组质粒，测序。3.根据权利要求2所述的P150sal2启动子-荧光素酶真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤A中所述的设计引物从人类NHF细胞DNA中通过PCR的方法用Taq酶克隆得到 pl50Sa12启动子，然后经过^(hol+Hindlll双酶切将启动子切为粘性末端，插入PGL3真核表达载体，构建重组的pl50Sal2-luCiferase真核表达载体。4.根据权利要求2所述的P150sal2启动子-荧光素酶真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤B中所述的进行PCR梯度扩增是指采用热启动两步法进行PCR和采用热启动两步法进行PCR，其中采用热启动两步法进行PCR 以NHF0. 7 μ g- μ L细胞DNA为模版，上游引物为Fl下游引物为R1，进行PCR ；采用热启动两步法进行PCR，以第一步结果中的2样品为模版，上游引物为F2下游引物为R2，进行PCR。5.根据权利要求2所述的P150sal2启动子-荧光素酶真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤D-I中所述的纯化化的方法是PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约2. 4kb的扩增条带，将目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化。6.根据权利要求2所述的P150sal2启动子-荧光素酶真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤D-2中所述的连接方法是在反应体系中加入回收的DNA片段8 μ 1和载体片段 2μ 1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李大伟，武正华，蔺剑，施丽丹，D·柯伊拉腊，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31