纤维素材料的处理和用于其中的酶制造技术

本发明专利技术涉及纤维素材料的处理和用于其中的酶。具体涉及从纤维素材料中生产糖水解物。该方法可用于例如生产可发酵糖用于从木质纤维素材料中生产生物乙醇。本发明专利技术描述了纤维素水解酶及其通过重组技术的生产，以及所述酶及酶制剂的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从纤维素材料生产糖水解物。更精确地说，本专利技术涉及从木质纤维素材料利用酶转换生产可发酵糖。可发酵糖可用于例如生产生物乙醇或其它用途。本专利技术特别涉及以纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)、内切葡聚糖酶(endoglucanase)、β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)及任选的木聚糖酶(Xylanase)处理纤维素材料的方法，并涉及酶制剂及其用途。本专利技术进一步涉及新颖的纤维素分解多肽、编码该多肽的多核苷酸， 并涉及包含该多核苷酸的载体及宿主细胞。本专利技术更进一步涉及该多肽的用途以及制备该多肽的方法。
技术介绍
糖水解物可用于微生物生产多种多样的精细化学品或生物聚合物，诸如有机酸， 例如乳酸，或乙醇或其它醇，例如正丁醇、1，3_丙二醇或聚羟基链烷酸酯(PHA)。糖水解物亦可作为其它例如用于富集、分离及纯化高价值糖的非微生物方法或许多聚合方法的原料。糖水解物的主要用途之一是生产生物燃料。生物乙醇和/或其它化学品的生产可能发生于生物炼制的一体化工艺中(Wyman 2001)。化石燃料的资源有限，及其所释放的二氧化碳量增加并导致温室现象，唤起了使用生物质作为可再生和清洁的能源来源的需求。从纤维素材料生产生物燃料即乙醇是一种有前景替代技术。生物燃料是目前运输业的唯一选择，其可以数量级减少二氧化碳的排放。 乙醇可用于现行的交通工具及配送系统，因此毋须昂贵的基础设施投资。源自木质纤维素再生性原料的糖亦可用作各种各样可取代油基化学品的化学产品的原料。植物中大部分碳水化合物是木质纤维素的形式，木基本上由纤维素(cellulose)、 半纤维素(hemicellulose)、果胶(pectin)及木质素(Iignin)组成。在木质纤维素到乙醇的方法中，木质纤维素材料首先经化学或物理预处理，使纤维素成分更容易水解。接着纤维素部分被水解以得到可经酵母菌发酵成为乙醇的糖。木质素是得到的主要副产品，其可用作固体燃料。生物乙醇的生产成本高且其能量输出低，是该方法更经济的研究仍在持续进行中。酶法水解被认为是将纤维素生物质转换成可发酵糖的最有前景的技术。然而，酶法水解在工业规模中仅被有限地被利用，特别是当利用高度木质化的材料如木材或农业废弃物时，该项技术不令人满意。酶法步骤的成本是该方法的主要经济因素的一。已经作出许多努力以改善纤维素材料酶法水解的效率(Badger 2002)。US2002/0192774A1描述用于转换固体木质纤维素生物质成为可燃烧的燃料产物的连续方法。经湿式氧化或汽爆的预处理后，该生物质被部份分离成为纤维素、半纤维素及木质素，然后利用一或多种碳水化合酶(EC3. 2)进行部份水解。CelluClastTM，N0V0 NordiskA/S公司的商品，含有纤维素酶及木聚糖酶活性，被提供作为范例。US2004/0005674A1描述可直接用于木质纤维素底物上的新颖酶混合物，从而可以避免预处理过程中形成的毒性废弃物并可以节省能源。该增效的酶混合物包含纤维素酶及辅助酶如纤维素酶、木聚糖酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶或葡萄糖醛酸酶或其任何组合物。考虑的纤维素酶包含内切葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)及纤维二糖水解酶 (CBH)。该实施例说明木霉木聚糖酶及纤维素酶制剂的混合物的用途。Kurabi等人^00 研究了以新颖及商品化的真菌纤维素酶来酶法水解经汽爆及乙醇有机溶剂预处理的花旗松。他们测试了两种商品化的里氏木霉(Trichoderma reesei) 纤维素酶制剂及两种由木霉属(Trichoderma sp.)及青霉属(Penicillium sp.)的突变菌株产生的新颖制剂。木霉属制剂相较于其它制剂显示显著更好的表现。更好的表现至少有部分被认为是由于显著较高的葡萄糖苷酶活性所致，其减轻纤维二糖水解酶及内切葡聚糖酶的产物抑制。US2004/0053373A1是关于一种将纤维素转换成葡萄糖的方法，通过以包含纤维素酶及经修饰的纤维二糖水解酶I (CBHI)的酶混合物处理经预处理的木质纤维素底物。该 CBHI已通过灭活其纤维素结合结构域(CBD)加以修饰。CBHI修饰的优点为例如高底物浓度下较好的回收及较高的水解率。纤维素酶选自EG、CBH及BG。优选CBHI得自木霉菌。US2005/0164355A1描述了在至少一种表面活性剂存在时，以一或多种纤维分解酶分解木质纤维素材料的方法。其它的酶诸如半纤维素酶、酯酶、过氧化物酶、蛋白酶、漆酶 (Iaccase)或其混合物亦可以使用。表面活性剂存在相较于表面活性剂不存在，可增加木质纤维素材料的分解。纤维分解酶可以是任何参与木质纤维素分解的酶，包括CBH、EG及BG。有大量文献公开了各种纤维素酶及半纤维素酶。纤维二糖水解酶(CBHs)公开于例如W003/000941，其涉及得自各种真菌的CBHI 酶。未提供所述酶的生理特性，亦未提供其用途的任何实施例。Hong等人(2003b)表征了产生于酵母菌中的金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus) CBHI的特征。该酶的应用未描述。Tuohy等人Q002)描述了得自埃莫森篮状菌(Talaromyces emersonii)的3种形式的纤维二糖水解酶。Cel5家族的内切葡聚糖酶(E(is fam 5)被描述于例如W003/062409，其涉及用于饲料应用的包含至少2种热稳定性酶的组成物。Hong等人(2003a)描述于酵母菌中生产来自金黄色嗜热子囊菌的热稳定性β_1，4-内切葡聚糖酶。其应用未解释。W001/70998涉及得自篮状菌的葡聚糖酶。它们还描述了得自埃莫森篮状菌的葡聚糖酶。讨论了食物、饲料、饮料、酿造及清洁剂应用。并未提及木质纤维素水解。W098/06858描述了得自黑曲霉菌(Aspergillus niger)的β _1，4-内切葡聚糖酶，且讨论了该酶于饲料及食物上的应用。W097/13853描述了在cDNA文库中筛检编码酶的DNA片段的方法。该cDNA文库是酵母菌或真菌源的，优选来自曲霉菌。该酶优选为纤维素酶。VanPetegem等人^00 描述了来自金黄色嗜热子囊菌的Cel5家族内切葡聚糖酶的三维结构。Parry等人^00 描述了来自金黄色嗜热子囊菌的Cel5家族内切葡聚糖酶的作用模式。Cel7家族的内切葡聚糖酶(E(is fam 7)被披露于例如US5，912，157，其关于毁丝霉属(Myceliophthora)内切葡聚糖酶及其同源物及其于清洁剂、纺织及纸浆上的应用。 US6, 071，735描述于碱性条件下展现高度内切葡聚糖酶活性的纤维素酶。讨论了作为清洁6剂在纸浆和造纸及纺织应用上的用途。未提及生物乙醇。US5，763，2M公开了分解纤维素 /半纤维素且于CBD中具有保守的氨基酸残基的酶。Cel45家族的内切葡聚糖酶(E(is fam 45)被描述于例如US6，001，639，其涉及具有内切葡聚糖酶活性且具有2个保守氨基酸序列的酶。一般性讨论了在纺织、清洁剂及纸浆和造纸应用上的用途，并提及木质纤维素材料的处理，但未提供实施例。W02004/053039 涉及内切葡聚糖酶的清洁剂应用。US5，958，082公开了内切葡聚糖酶、特别是得自太本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种纤维二糖水解酶多肽，其包含具有纤维素分解活性的片段，且选自：ａ）包含至少与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４具有６６％同一性或与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６具有７９％同一性的氨基酸序列的多肽；ｂ）包含具有纤维素分解活性片段的ａ）的变异体；及ｃ）具有纤维素分解活性的ａ）或ｂ）的片段。

【技术特征摘要】
2005.12.22 FI 20051318;2005.12.22 US 60/753,2581.一种纤维二糖水解酶多肽，其包含具有纤维素分解活性的片段，且选自a)包含至少与SEQID NO 4具有66%同一性或与SEQ ID NO 6具有79%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含具有纤维素分解活性片段的a)的变异体；及c)具有纤维素分解活性的a)或b)的片段。2.权利要求1的多肽，其包含a)与SEQID NO :4或6具有至少80%同一性的氨基酸序列；b)包含具有纤维二糖水解酶活性的片段的a)的变异体；或c)具有纤维二糖水解酶活性的a)或b)的片段。3.一种分离的多核苷酸，选自a)SEQ ID NO :3或5的核苷酸序列，或编码权利要求1的多肽的序列；b)a)的互补链；c)包含至少20个核苷酸的a)或b)的片段；及d)由于基因密码而与a)、b)或c)所定义的任一序列简并的序列。4.权利要求3的多核苷酸，其具有SEQID NO :3或5所包含的序列。5.权利要求3的多核苷酸，其包含选自登录号DSM167 和DSM167^的微生物所包含的基因。6.一种载体，其包含作为异源性序列的权利要求3至5中任一项的多核苷酸。7.权利要求6的载体，其能够表达权利要求1的多肽。8.一种宿主细胞，其包含权利要求6的载体。9.权利要求8的宿主细胞，其能够表达由异源性多核苷酸序列所编码的多肽。10.权利要求9的宿主细胞，其是木霉属或曲霉属的菌株。11.一种大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，其登录号为DSM 167 或DSM 16729。12.—种酶制剂，其包含权利要求1的多肽。13.权利要求12的酶制剂，其是耗尽培养基、粉末、颗粒或液体的形式。14.权利要求12或13的酶制剂，其包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶及任选的木聚糖酶活性和/或其它酶活性。15.权利要求12至14中任一项的酶制剂，其进一步包含传统添加剂。16.权利要求12的酶制剂，包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶，其中所述纤维二糖水解酶包含与SEQ ID NO :4或6或与其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。17.权利要求16的酶制剂，其中所述纤维二糖水解酶可得自嗜热枝顶孢菌。18.权利要求17的酶制剂，其中所述纤维二糖水解酶可得自嗜热枝顶孢菌CBS 116240ο19.权利要求16的酶制剂，其中所述酶是重组酶，优选在木霉属或曲霉属的菌株中产生。20.权利要求16的酶制剂，其中所述内切葡聚糖酶包含与SEQIDNO 10、12、14或16或与其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。21.权利要求20的酶制剂，其中所述内切葡聚糖酶可得自金黄色嗜热子囊菌、嗜热枝顶孢菌或嗜热毛壳菌，优选得自金黄色嗜热子囊菌CBS 116239、嗜热枝顶孢菌CBS 116240 或嗜热毛壳菌CBS 730.95。22.权利要求16的酶制剂，其中所述β-葡萄糖苷酶包含与SEQ IDNO 22,24或沈或与其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。23.权利要求22的酶制剂，其中所述β-葡萄糖苷酶可得自金黄色嗜热子囊菌、嗜热枝顶孢菌或嗜热毛壳菌，优选得自金黄色嗜热子囊菌CBS 116239、嗜热枝顶孢菌CBS 116240 或嗜热毛壳菌CBS ...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚里·韦赫曼佩雷，玛丽卡·阿拉普拉内恩，泰尔希·普拉宁，马蒂·西伊卡阿霍，亚尔诺·卡利奥，萨图·胡曼，桑尼·沃蒂莱内，啼姆·哈罗内，利萨·维卡里，
申请(专利权)人：罗尔公司，
类型：发明
国别省市：FI