本发明专利技术公开了一种新的用于治疗或预防肉瘤复发转移的疫苗，该疫苗由下述方法制备而成：新鲜的肉瘤组织剪碎，将肉瘤细胞裂解，裂解液离心，取上清，所得上清浓缩或透析后上层析柱，截取分子量在５０～１５０ＫＤ段，分装，冻干即得。本发明专利技术肉瘤疫苗的组成成分以ＨＳＰ－６０为主，同时含有Ｇｐ－９６、ＨＳＰ－９０、ＨＳＰ－７０，以ＨＳＰ－７０含量为最少。动物模型试验证实，本发明专利技术肉瘤疫苗对于肉瘤具有显著的防治作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种疫苗，尤其涉及一种从肉瘤组织中提取制备的混合热休克蛋白/肽肉瘤疫苗，属于蛋白质工程领域。
技术介绍
热休克蛋白HSP-70(heat shock protein，HSP)，Gp-96(glycoprotein-96)是一种分子伴侣，具有结合肿瘤抗原和递呈抗原的作用，从肿瘤细胞中分离提取的HSP-70和Gp-96携带了广谱肿瘤抗原，两者都可诱发CD4+，CD8+细胞反应，即促进了特异性细胞免疫，可作为疫苗，是诱发机体的抗肿瘤免疫作用的重要手段。HSP-60具有活化机体非特异免疫作用，它可活化吞噬细胞、树突状细胞、γδT细胞和自然杀伤细胞，从而释放多种细胞因子，并杀伤肿瘤细胞。现有技术中以热休克蛋白为成分所制备的疫苗，其组成仅只包括HSP-70或Gp-96，不含HSP-60。目前，进入临床试用的热休克蛋白疫苗主要有两种，均由美国Antigenics Inc生产。一种名称为Oncophage，其成分为Grp-96，美国FDA批准进入临床3期，所治疗的对象都是癌(肾癌，胰腺癌和黑色素瘤等8种)；另外一种是AG-858，其成分是HSP-70，已进入临床2期试验，主要治疗慢性白血病。用基因重组的方法制备HSP-60，再与已知抗原组合制成肿瘤疫苗也有相关文献报道，但该类肿瘤疫苗主要是针对病毒抗原及其诱发的乳头状鳞状细胞癌。目前尚未有将含有HSP-60的混合热休克蛋白/肽制备成肉瘤疫苗的文献报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够有效治疗肉瘤的混合热休克蛋白/肽疫苗。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的本专利技术混合热休克蛋白肉瘤疫苗，由以下方法制备而成新鲜的肉瘤组织剪碎后将肉瘤细胞裂解，将所得的肉瘤细胞裂解液离心，取上清，所得上清浓缩或透析后上层析柱，截取分子量在50～150KD段，分装，冻干即得。上述制备方法中，所述的肉瘤组织可为肉瘤患者手术切除的新鲜自我瘤组织，包括骨肉瘤、软骨肉瘤、滑膜肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、巨细胞肉瘤、尤文氏瘤等，或建株的肉瘤细胞。上述制备方法中所述的层析柱为Sephacryl S-200HR。通过以上制备方法可将肉瘤组织中具有免疫激活作用的多种热休克蛋白/肽一次性最大限度的提取出来，其组成成分以HSP-60为主，同时含有有Gp-96、HSP-90和HSP-70，而以HSP-70含量最少。本专利技术混合热休克蛋白疫苗较其他疫苗有其独特的优点，因为它通过HSP-70，Gp-96携带了大量的多种肿瘤抗原，近似于抗原库，从而形成多价疫苗，活化了特异性免疫，同时通过HSP-60、HSP-70、Gp-96也活化了非特异免疫，释放多种抗肿瘤的细胞因子，如IL-2，IL-12，TNF-α，IFN-γ等，从而能够取得较好的抗肿瘤效果。本专利技术肉瘤疫苗不需另外加佐剂，制备简便，消除了佐剂可能带来的副作用。本专利技术肉瘤疫苗在制备过程中去除了肿瘤本身可能存在的免疫抑制因子，如TGF-β或可转譯的DNA等，从而使本专利技术疫苗的免疫效果进一步提高，并避免了可能的副作用。用法与用量本专利技术肉瘤疫苗免疫小鼠的有效剂量范围为2-30ug，以20ug为最佳。皮下注射，免疫3次为一疗程。以下通过实施例来进一步描述本专利技术的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本专利技术的保护范围。说明书附1分子筛蛋白流出记录曲线。其中以BSA为标准分子量参照，表明F2段为需要收集的目的蛋白。图2分子筛凝胶层析后将F2段每30min收集不同时段流出液进行SDS-PAGE蛋白电泳。Lanel分子筛前浓缩混合蛋白，杂蛋白多，背景模糊；Lane 2-10经分子筛后每30min所收集流出液，可见目的蛋白集中于3-6道；7-10道为小分子量蛋白，电泳中已跑出胶外。图3ConA亲和层析后SDS-PAGE电泳图及Western-blot鉴定。1.标准分子量蛋白；2.ConA亲和层析前，蛋白条带较多；3.ConA亲和层析未结合部分，以60、70×103分子量蛋白为主；已无grp96条带；4.ConA亲和层析结合洗脱部分，在97×103附近有微细的蛋白条带；5.抗Gp96 Western-blot染色，条带显色弱。图4ADP亲和层析后SDS-PAGE电泳图及Western-blot鉴定。1.标准分子量蛋白；2.ADP未结合部分，以HSP60为主；3.ADP结合洗脱部分，为纯化HSP70；4.抗HSP60 Westem-blot染色；5.抗HSP70 Western-blot染色；具体实施方式本专利技术骨肉瘤疫苗的制备一、材料和方法1、材料来源小鼠S180肉瘤细胞(购自美国ATCC公司)。2、疫苗的制备步骤1)剪碎肉瘤组织，将肉瘤细胞在体外42℃加温6小时，研磨，加10倍体积细胞裂解液(30mM NaHCO3，0.5mM PMSF，pH 7.1)，摇震破膜，2)将上述所得的细胞裂解液4℃，25000rpm(75000g)超速离心2.5h，弃沉淀，蛋白测定，3)上清冷冻干燥至约2ml，分子筛洗脱液(0.05M Tris-HCl，0.15MNaCl，pH7.2)透析，4)牛清白蛋白预流为标准参照牛清白蛋白(68KD)上层析柱SephacrylS-200HR，柱长100cm，流速21.6/h，记录流出时间及图形，见附图说明图1。5)将透析后的样品上清上层析柱Sephacryl S-200HR(购自Pharmacia公司)，同前，柱长100cm，流速21.6/h，加样浓度约100-150mg/ml，样品完全进入分子筛后，加入分子筛洗脱液，每30min分部收集一瓶，在紫外监测下，根据紫外监测图形，截取分子量在50～150KD段(约相当于牛清白蛋白流出峰)，即收集第2段的3、4、5、6瓶，混合后即为本疫苗，见图2。6)分装，冻干待用。3、鉴定1)分子筛收集第2段的3、4、5、6瓶，混合后，适当浓缩，用con A洗脱液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl，10mM MgCl2，10mM CaCl2，15mM巯基乙醇)透析3h，上Con A柱(购自Pharmacia公司)，室温放置30min，洗脱，收集未结合部分，再用10％甲基甘露糖洗脱，洗脱液经SDS-PAGE，Westernblot鉴定(见图3)。2)Con A未结合部分，适当浓缩，用ADP柱平衡液(20mMTris-HCl，pH7.5，20mMNaCl，3mM MgCl2，15mM巯基乙醇，0.5mM PMSF)透析3h，上ADP柱(购自Sigma公司)，室温放置30min，用ADP柱洗脱液(20mMTris-HCl，pH7.5，500mM NaCl，3mM MgCl2，15mM巯基乙醇，0.5mM PMSF)洗脱，流速30min/h，分别收集洗脱部分及未结合部分，分别进行SDS-PAGE，Westernblot鉴定(见图4)。3)将上述提取所得分别进行SDS-PAGE，Western blot鉴定，鉴定结果证明包括HSP-70，-60，，-96。SDS-PAGE堆积胶4％，分离胶10％，电泳后，转移至硝酸纤维素膜，约90min，分别用抗HSP-70，-60，-96抗体进行酶联染色。结果见图2、3。4、收率Lowry本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种混合热休克蛋白／肽肉瘤疫苗，主要由下述方法制备而成：新鲜的肉瘤组织剪碎，将肉瘤细胞裂解，裂解液离心，取上清，所得上清浓缩或透析后上层析柱，截取分子量在５０～１５０ＫＤ段，分装，冻干即得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：袁玫，卢世璧，汤宇，崔雪梅，孙明学，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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