人二倍体细胞狂犬病疫苗毒种及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是利用人二倍体细胞（ＫＭＢ１７）生产用于预防人类狂犬病的疫苗毒种及其制备方法。本发明专利技术是将狂犬病固定毒ＣＴＮ－１Ｖ５株连续在人二倍体细胞（ＫＭＢ１７）中传代，并以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，从而获得适应于人二倍体细胞（ＫＭＢ１７）并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出可在人二倍体细胞（ＫＭＢ１７）高效增殖的狂犬病疫苗毒种（ＣＴＮ－ＤＫ株）。用该毒种生产人二倍体细胞（ＫＭＢ１７）狂犬病疫苗可以有效避免当前国内使用的疫苗中异种ＤＮＡ残留引起的风险，将进一步提高我国狂犬病疫苗的安全性和实用性，具有重大的社会效益和经济效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是利用人二倍体细胞(KMB17)生产用于预防人类狂犬病的疫苗毒种及其制备方法。 
技术介绍
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种疾病，一旦发病，100％死亡。我国近年来狂犬病疫情持续上升，发病率现居世界第二位，仅次于印度，狂犬病病死人数居37种法定报告传染病之首。狂犬病至今无法治愈但可有效预防，因此我国狂犬病的预防工作就显得尤为重要。 目前世界用于生产狂犬病疫苗的培养基质细胞主要有地鼠肾细胞、鸡胚细胞和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)等动物源性细胞。动物源性原代细胞不能排除细菌、病毒、寄生虫等外源致病因子的污染，且有生产规模不易扩大、环保难解决等缺点；而Vero细胞由于是传代细胞系，有一定的致瘤性，疫苗中细胞残余DNA必须达到标准，而且其最大的缺点是该细胞株没有我国自主知识产权。人二倍体细胞为人源性正常核型细胞，无致癌性，无异种DNA，其安全性无疑要高于动物源性细胞。目前我国使用的狂犬病疫苗种类虽多，但质量良莠不齐，至今尚无被WHO、FDA等组织肯定和推荐的人二倍体细胞培养疫苗，而基本是用地鼠肾细胞、Vero细胞和鸡胚细胞等动物源性细胞培养的疫苗。国外生产的人二倍体细胞狂犬病疫苗，如美国Wyeth厂、法国Merieux研究所和德国Behring厂生产的二倍体疫苗，已证实其具有良好的免疫原性和安全性，但用人二倍体细胞培养狂犬病毒，有病毒滴度相对较低、疫苗成本高及价格昂贵等缺点，难以广泛使用。 
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有我国自主知识产权，适应于人二倍体细胞(KMB17)，具有良好免疫原性和传代稳定性，并且易于大量扩增的狂犬病疫苗 毒种及其制备方法。用该毒种生产人二倍体细胞(KMB17)狂犬病疫苗，将进一步提高我国狂犬病疫苗的安全性和实用性，以便能更安全、有效地预防人类狂犬病。 1984年WHO第7次狂犬病专家委员会将CTN-1V5株认可为狂犬病毒固定株，列为可用于生产疫苗的病毒株。本专利技术是将狂犬病固定毒CTN-1V5株连续在人二倍体细胞(KMB17)中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，再经连续传代，获得适应于人二倍体细胞(KMB17)并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出在人二倍体细胞(KMB17)高效增殖的狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，该狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，分类命名为狂犬病毒Rabies virus，已于2010年07月16日保藏于中国微生物生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.3989。 CTN-1V5株经过在人二倍体细胞(KMB17)中传代适应，其病毒滴度由第1代的4.5lgLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9lgLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7.0lgLD50/ml以上。--> 本专利技术的人二倍体细胞(KMB17)的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养液由Eagle液、乳蛋白及一定量的新生牛血清组成。 具体制备方法步骤如下： 1、用由Eagle液、乳蛋白及2％～15％的新生牛血清组成的细胞营养液，于35℃～37℃培养扩增人二倍体细胞(KMB17)。 2、将狂犬病固定毒CTN-1V5株在人二倍体细胞(KMB17)中传代，收获所得病毒命名为CTN-DK株。传代方法为当细胞长成致密单层后，用胰酶-EDTA消化，收集细胞，将CTN-1V5株按0.005～1.0MOI剂量，以悬浮细胞接种法接种于人二倍体细胞(KMB17)，于32℃～37℃，PH7.2～8.0培养，培养2～20天后收获病毒即狂犬病毒固定毒CTN-DK1，并以相同方法继续传代。 3、当传代至CTN-DK20时以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒继续传代9代，命名为CTN-DK29，再以CTN-DK29经终末稀释法筛选并传4代，命名为CTN-DK33，再以CTN-DK33经终末稀释法筛选并传至47代。 4、CTN-1V5株经过在人二倍体细胞(KMB17)中连续传代，逐渐适应于人二倍体细胞(KMB17)，其病毒滴度由第1代的4.5lgLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9lgLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7.0lgLD50/ml以上。 5、病毒的接种方式是悬浮细胞接种法，病毒接种剂量为0.005～1.0MOI，培养温度为32℃～37℃，PH7.2～8.0，病毒收获时间为接种病毒后2～20天。该毒种参照《中华人民共和国药典》三部(2005年版)“人用狂犬病疫苗” 毒种的无菌检查、支原体检查、鉴别试验、外源因子检查和免疫原性检查方法检测，检测结果均达到药典要求的标准。经测定，毒种中和指数为3981，保护指数为≥776，均大大超过药典所要求中和指数不低于500和保护指数不低于100的标准。研究同时表明，此毒种的G蛋白基因在人二倍体细胞(KMB17)传代时具有遗传稳定性。 本专利技术的液体毒种保存于-60℃以下，有效期可达3年半以上，毒种真空冷冻干燥后可于-60℃以下长期保存。 用毒种(CTN-DK株)制备了3批试验性疫苗，经免疫原性、豚鼠异常毒性试验、残余活病毒检查(包括细胞盲传三代后小鼠脑内接种)和效价测定等均证明安全有效，其中一批经国家(浙江)新药安全性评价研究重点实验室的安全性评价(小鼠im急性毒性试验、豚鼠全身主动过敏试验、大鼠被动皮肤过敏试验)，结论为安全。 本专利技术具有以下技术效果： 本专利技术制备的毒种可用细胞工厂大量增殖。以细胞工厂制备毒种的培养方式与传统的克氏瓶相同，但与前者相比，有培养面积大，制备批量大，占用空间小，操作简便，污染机会小等的优点。毒种(CTN-DK株)用细胞工厂大量增殖的滴度与用克氏瓶制备毒种的滴度相当。 本专利技术的毒种(CTN-DK株)是一种已经适应于人二倍体细胞(KMB17)，具有良好免疫原性和传代稳定性，符合《中华人民共和国药典》三部(2005年版)“人用狂犬病疫苗”毒种要求，并且易于大量扩增的狂犬病毒毒种。用该毒种生产的人二倍体细胞(KMB17)狂犬病疫苗具有安全性和有效性，可以避免当前国内使用的疫苗中异种DNA残留引起的风险，将进一步提高我国狂犬病疫苗的安全性，具有重大的社会效益和经济效益。--> 具体实施方式实施例1： 用由Eagle液、乳蛋白及2％～15％的新生牛血清组成的细胞营养液，于35℃～37℃培养扩增人二倍体细胞(KMB17)。当细胞长成致密单层后，用胰酶-EDTA消化，收集细胞，将CTN-1V5株按0.005～1.0MOI剂量，以悬浮细胞接种法接种于人二倍体细胞(KMB17)，于32℃～37℃，PH7.2～8.0培养，培养2～20天后收获病毒即狂犬病毒固定毒CTN-DK1，并以相同方法继续传代。当传代 至CTN-DK20时以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒继续传代9代，命名为 CTN-DK29，再以CTN-DK29经终末稀释法筛选并传4代，命名为CTN-DK33，再以CTN-DK33经终末稀释法筛选并传至47代。CTN-1V5株经过在人二倍体细胞(KMB17)中连续传代，逐渐适应于人二倍体细胞(KMB17)，其病毒滴度由第1代的4.5lgLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9lgLD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人二倍体细胞狂犬病疫苗毒种，其特征在于将狂犬病固定毒ＣＴＮ－１Ｖ５株连续在人二倍体细胞（ＫＭＢ１７）中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，再经连续传代，获得适应于人二倍体细胞（ＫＭＢ１７）并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出在人二倍体细胞（ＫＭＢ１７）高效增殖的狂犬病疫苗毒种（ＣＴＮ－ＤＫ株），该狂犬病疫苗毒种（ＣＴＮ－ＤＫ株），其保藏号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．３９８９。

【技术特征摘要】
1.一种人二倍体细胞狂犬病疫苗毒种，其特征在于将狂犬病固定毒CTN-1V5株连续在人二倍体细胞(KMB17)中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，再经连续传代，获得适应于人二倍体细胞(KMB17)并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出在人二倍体细胞(KMB17)高效增殖的狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，该狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，其保藏号为CGMCC No.3989。2.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于毒种病毒滴度≥7.0lgLD50/ml。3.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于毒种在人二倍体细胞(KMB17)传代，其G蛋白基因具有稳定性。4.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于液体毒种-60℃以下可保存3年半以上，毒种真空冷冻干燥后于-60℃以下长期保存。5.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种的制备方法，其特征在于具体制备方法步骤为1)用由Eagle液、乳蛋白及2％～15％的新生牛血清组成的细胞营养液，于35℃～37℃培养扩增人二倍体细胞(KMB17)。2)将狂犬病固定毒CTN-1V5株在人二倍体细胞(KMB17)中传代，收获所得病毒命名为CTN-DK株。传代方法为细胞长成致密单层后，用胰酶-EDT...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛子安，黄海鹰，姜立民，李永学，陈秋红，林晓波，高磊，严宵，周康凤，
申请(专利权)人：浙江普康生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]