本发明专利技术公开了一种人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的快速适应方法，将新鲜狂犬病毒接种人二倍体细胞上，带毒传代，仅需4-5个循环，传代12-15代，病毒滴度从第P1代的3.0logLD50/ml升至P15代的7.0logLD50/ml以上，缩短病毒的适应周期至少50%，在不影响病毒免疫原性的前提下快速提高病毒产量，节约人力物力。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，将新鲜狂犬病毒接种人二倍体细胞上，带毒传代，仅需4-5个循环，传代12-15代，病毒滴度从第P1代的3.0logLD50/ml升至P15代的7.0logLD50/ml以上，缩短病毒的适应周期至少50%，在不影响病毒免疫原性的前提下快速提高病毒产量，节约人力物力。【专利说明】专利技术所属领域:本专利技术属于疫苗
，具体地的说，本专利技术涉及。
技术介绍
狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的人畜共患的自然疫源性疾病，是中国法定报告中死亡数和病死率最高的传染性疾病。据2003年世界狂犬病调查报告显示，中国的发病人数仅次于印度，居世界第二位，中国卫生部已将狂犬病列为2类传染病加以管理，但近年来中国狂犬病疫情一直呈上升趋势，疫情形势十分严峻。目前世界大量生产的狂犬疫苗有二倍体细胞狂犬疫苗、Vero细胞灭活疫苗、地鼠肾细胞、鸡胚、鸭胚疫苗。实验已经证明，在人体试验中所使用的任何疫苗的免疫原性都无法和人二倍体细胞HDCV相比。人二倍体细胞为正常核型细胞，无致癌性，并且由于HDCV所具有的高免疫性和良好的耐受性，目前已经成为评价任何一种人用新疫苗的标准疫苗。HDCV的一个缺点是在HDCV上培养的狂犬病毒滴度相对较低，这使得疫苗的价格非常昂贵。狂犬病毒在人二倍体细胞上培养毒种必须先在细胞上进行适应。国内外的相关研究机构均做了大量的适应实验，如US3397267 (Mario V.Fernandes et.al)描述了 CVS、PM、HEP毒株在W1-38上的适应方法，是通过用感染的细胞传代，在传代过程中逐渐加大未感染病毒的细胞比例，进行连续传代，使病毒连续适应于细胞中增殖，约需要30-40代后才能适应。在未适应二倍体细胞之前用病毒悬液加正常细胞传代，其病毒滴度约为3.021ogLD5(l/ml，而通过带毒细胞传代后，其滴度可达7.01ogLD5(l/ml。我国中检所严子林等人采用相同的方法，用适应小鼠的狂犬固定毒CTN鼠脑悬液在KMB-17上适应，37代以前主要用带毒细胞加正常细胞混合后进行传代，37代后用病毒悬液加正常细胞传代。病毒滴度变化，2代1.0，4 代 1.56，14 代 1.98，26 代 3.17，37-38 代 4.5，39-40 代 3.5-4.0，41-50 代 4.5-6.33，51-106代，2个代次为6.16-6.23，34个代次为4.5-5.5，15个代次为3.9-4.33，大部分代次在4.5-5.5/0.03ml之间，40代后CTN鼠脑病毒适应人二倍体细胞。浙江普康生物技术股份有限公司毛子安等人，将狂犬病毒固定毒CTN-1V5株连续在KMB-17中传代，并以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，病毒滴度由第I代的4.51ogLD5(l/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9logLD50/ml，传代至47代病毒滴度基本稳定在7.01ogLD50/mL.以上这些方法均采用带毒传代并且需逐渐加大新鲜细胞的方法进行，需传代40代以上才能适应，耗时太长，且滴度较低。
技术实现思路
:本专利技术的目的是克服现有工艺存在的不足之处，提供一种人用狂犬病病毒株在人二倍体细胞的快速适应方法，缩短病毒的适应周期，在不影响病毒免疫原性的前提下快速提高病毒产量，节约人力物力。为达到上述目的，本专利技术公开了一种人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，该方法包括下列步骤:1)将新鲜狂犬病毒按0.0001-1M0I接种入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液中，在30-40°C吸附30-90分钟，补加细胞培养液至合适体积，30-40°C培养，2-5天成致密单层，弃细胞培养液，换病毒维持液，再培养3-7天，收获培养上清液，补加5-30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒Pl代；2)带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代； 3)再次带毒细胞消化传代，依1:1-1: 3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代；4)接种步骤3)收获的病毒，重复步骤I )，2)，3)，为一个循环，经过4_5个循环，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。在本专利技术中，所述的人胚肺二倍体细胞为W1-38或MRC-5或KMB-17或Walvax-2，CCTCC C201055。优选为人胚肺二倍体细胞 Walvax-2，CCTCC C201055。在本专利技术中，所述的分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液是指将处于对数生长期的人胚肺二倍体细胞用胰酶消化分散，加培养液后离心并去上清，细胞沉淀用无血清培养液悬浮制得；在本专利技术中，病毒吸附细胞在30-40°C吸附30-90分钟，优选的，病毒在36°C吸附细胞60分钟；在本专利技术中，感染细胞在36°C培养，3-5天成致密单层。在本专利技术中，所使用的细胞培养液为含5%_20%牛血清的MEM培养液；病毒维持液是含5%牛血清和1%蔗糖的MEM培养液。在本专利技术中，人用狂犬疫苗毒种为CTN-1V5株或aG株或PM株，优选CTN-1V5株。在本专利技术中，一种优选的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，该方法包括下列步骤:I)将新鲜狂犬病毒CTN-1V5株按0.01M0I接种病毒入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞Walvax-2悬液中，在36°C吸附60分钟，补加细胞培养液至合适体积，36°C培养，4-5天成致密单层，弃细胞培养液，换含5%牛血清和1%蔗糖的MEM病毒维持液，再培养3-7天，收获培养上清液，补加5-30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒Pl代；2)带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，36°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代；3)再次带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，36°C培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代；4)接种步骤3)收获的病毒，重复步骤1)，2)，3)，为一个循环，经过4-5个循环，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。在本专利技术中，经过4-5个循环，传代12-15代，细胞CPE逐渐增加，病毒滴度从第Pl代的 3.0logLD50Ail 升至 P15 代的 7.01ogLD50/ml 以上。在本专利技术中，新鲜狂犬病毒是指直接从患病的动物体内取出的材料，或标准病毒毒种在低温存放后接种敏感动物并致动物出现典型症状后收获的病毒材料，如将低温存放后的病毒毒种接种鼠脑传代2-3次后得到的材料。在本专利技术中，优选的人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2，保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201055，保藏日期是2010年7月13日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编 430072,电话:027_68752319。Email: cctcciwhu.edu.cn。在本专利技术中，病毒与细胞在36°C吸附细胞60分钟，细胞是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，该方法包括下列步骤：1）将新鲜狂犬病毒按0.0001?1MOI接种入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液中，在30?40℃吸附30?90分钟，补加细胞培养液至合适体积，30?40℃培养，2?5天成致密单层，弃细胞培养液，换病毒维持液，再培养3?7天，收获培养上清液，补加5?30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒P1代；2）带毒细胞消化传代，依1:1?1:3的传代比率传代，生长2?5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30?40℃培养3?7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代；3）再次带毒细胞消化传代，依1:1?1:3的传代比率传代，生长2?5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30?40℃培养3?7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代；接种步骤3）收获的病毒，重复步骤1），2），3），为一个循环，经过4?5个循环，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨喆，马波，何丽芳，王丽丽，李伟，陈敏，王馨，尹孝兵，
申请(专利权)人：云南沃森生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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