一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，依次包括以下步骤：人二倍体细胞株的复苏和传代培养；人二倍体细胞株的多级生物反应器培养；接种乙型脑炎病毒毒株，进行病毒增殖培养；收获病毒培养液；病毒培养液经灭活、超滤、纯化和添加糖蛋白保护剂后，配制疫苗。本发明专利技术本发明专利技术采用人二倍体细胞作为细胞基质，安全且无外源因子污染；采用逐级线性放大的生物反应器培养，易于实现较低成本，较高质量安全性和稳定性的疫苗大规模化生产；每天抽样检测病毒收获液的滴度保证了所收获的病毒培养物的高表达，保证了生产质量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其是一种乙型脑炎灭活疫苗的生产方法。
技术介绍
乙型脑炎主要是由三带喙库蚊叮咬传播，病毒通过蚊虫叮咬进入人体内首先在局部组织和淋巴结复制，扩散至其他部位进一步复制后产生病毒血症，在机体免疫力低下或某些脑组织损伤的情况下病毒通过血-脑脊液屏障，侵犯中枢神经系统而发生脑炎。一旦发病，该病的病死率和愈后后遗症的比例较高。目前，预防性接种疫苗是防治该病的有效手段。目前，市场上广泛应用的主要有鼠脑纯化灭活疫苗，地鼠肾细胞灭活疫苗，乙型脑炎减毒活疫苗及Vero细胞灭活疫苗四种疫苗。鼠脑纯化灭活疫苗是将病毒接种感染小鼠后取其脑组织经过勻浆、澄清、去除杂蛋白、浓缩及灭活制备而成，疗效较为确切，但是由于脑组织残留和纯化问题，其大规模生产不易且成本过高。地鼠肾细胞灭活和减毒活疫苗疫苗制备过程中亦存在鼠源的性蛋白及生产中易出现污染等原因。而Vero细胞乙脑灭活疫苗虽说较易实现大规模的生产但存在DNA的残留问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术的不足，提供了。为达到上述目的，本专利技术采取了如下技术方案，依次包括以下步骤步骤一人二倍体细胞株的复苏和传代培养人二倍体细胞株经复苏、转瓶传代培养2 3代后，消化细胞并制备细胞悬液；步骤二 人二倍体细胞株的多级生物反应器培养；将经复苏、传代培养和消化后制成的人二倍体细胞悬液进行二级以上的生物反应器线性放大技术培养；步骤三接种乙型脑炎病毒毒株，进行病毒增殖培养生物反应器线性放大技术培养的最终生物反应器内的细胞密度达到IO6个/ml以上后，将细胞生长液更换为病毒维持液，并将乙型脑炎病毒毒株接种至其中，进行病毒增殖培养；步骤四收获病毒培养液更换病毒维持液M小时后，收获病毒培养液，同时每天抽样检测病毒培养液的滴度，每批次的培养液收获15 25天；步骤五收获的病毒培养液经灭活、超滤、纯化和添加保护剂后，配制疫苗。进一步的技术方案是，所述的人二倍体细胞株为WI-38，MRC-5，2BS，KMB17中的任一种，所述的乙型脑炎病毒毒株为P3株或SA14-14-2株。进一步的技术方案是，所述的生物反应器为搅拌式生物反应器或摇摆式气液交替培养生物反应器。进一步的技术方案是，所述病毒维持液为BME病毒维持液，所述保护剂为糖蛋白保护剂。进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株达到IO6个/ml以上的细胞密度后，消化，洗脱，离心沉淀，收集及重悬细胞，并按照放大比例通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器培养。进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级生物反应器中加入供细胞贴附的微载体和细胞悬液，所述一级生物反应器中加入的细胞悬液浓度为IO6个/ml以上，所述一级生物反应器培养的工作体积约10L，所述的放大比例为前一级生物反应器工作体积的10 20倍。进一步的技术方案是，所述的每一级生物反应器中加入的微载体为颗粒状实心微球载体、多孔性微球载体、网状纤维结构载体和片状纤维结构载体中的任一种。进一步的技术方案是，所述步骤四收获病毒培养液的方式为间隔式收获培养液或连续灌注式收获培养液。进一步的技术方案是，所述的间隔式收获培养液具体为间隔M 48小时收获培养体积80% 90%的病毒培养液后，继续补加BME维持液至原培养体积。进一步的技术方案是，所述的连续灌注式收获培养液具体为每天连续流出病毒培养液，并每天收获工作体积80% 90%的病毒培养液，同时连续等量补加BME维持液。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果(1)本专利技术采用人二倍体细胞作为细胞基质，安全且无外源因子污染。(2)本专利技术采用逐级线性放大的生物反应器培养，易于实现较低成本，较高质量安全性和稳定性的疫苗大规模化生产。(3)本专利技术每天抽样检测病毒收获液的滴度保证了所收获的病毒培养物的高表达，保证了生产质量。具体实施例方式实施例1，依次包括以下步骤步骤一人二倍体细胞株WI-38的复苏和传代培养人二倍体细胞株WI-38经复苏、转瓶传代培养2代后，消化细胞并制备细胞悬液；步骤二 人二倍体细胞株WI-38的多级生物反应器培养；将经复苏、传代培养和消化后制成的人二倍体细胞WI-38悬液进行二级的生物反应器线性放大技术培养；步骤三接种乙型脑炎病毒毒株P3，进行病毒增殖培养生物反应器线性放大技术培养的最终生物反应器内的细胞密度达到IO6个/ml后，将人二倍体细胞WI-38生长液更换为BME病毒维持液，并将乙型脑炎病毒毒株P3接种至其中，进行病毒增殖培养；步骤四收获病毒培养液更换BME病毒维持液M小时后，收获病毒培养液，同时每天抽样检测病毒培养液的滴度，每批次的培养液收获15天；步骤五收获的病毒培养液经灭活、超滤、纯化和添加糖蛋白保护剂后，配制疫苗。进一步的技术方案是，所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株 WI-38达到IO6个/ml的细胞密度后，消化，洗脱，离心沉淀，收集及重悬细胞，并按照放大比例通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器培养。进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级生物反应器中加入供细胞贴附的颗粒状实心微球载体和人二倍体细胞WI-38悬液，所述一级生物反应器中加入的人二倍体细胞 WI-38悬液浓度为IO6个/ml，所述一级生物反应器培养的工作体积约10L，所述的放大比例为前一级生物反应器工作体积的10倍。进一步的技术方案是，所述步骤四收获病毒培养液的方式为间隔式收获培养液， 具体为间隔M小时收获培养体积80%的病毒培养液后，继续补加BME维持液至原培养体积。实施例2—种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，依次包括以下步骤步骤一人二倍体细胞株MRC-5的复苏和传代培养人二倍体细胞株MRC-5经复苏、转瓶传代培养3代后，消化细胞并制备细胞悬液；步骤二 人二倍体细胞株MRC-5的多级生物反应器培养；将经复苏、传代培养和消化后制成的人二倍体细胞MRC-5悬液进行三级的生物反应器线性放大技术培养；步骤三接种乙型脑炎病毒毒株P3，进行病毒增殖培养生物反应器线性放大技术培养的最终生物反应器内的人二倍体细胞MRC-5密度达到IO7个/ml后，将人二倍体细胞MRC-5生长液更换为BME病毒维持液，并将乙型脑炎病毒毒株P3接种至其中，进行病毒增殖培养；步骤四收获病毒培养液更换BME病毒维持液M小时后，收获病毒培养液，同时每天抽样检测病毒培养液的滴度，每批次的培养液收获25天；步骤五收获的病毒培养液经灭活、超滤、纯化和添加糖蛋白保护剂后，配制疫苗。进一步的技术方案是，所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株 MRC-5达到IO7个/ml的细胞密度后，消化，洗脱，离心沉淀，收集及重悬细胞，并按照放大比例通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器培养。进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级生物反应器中加入供细胞贴附的多孔性微球载体和人二倍体细胞MRC-5悬液，所述一级生物反应器中加入的人二倍体细胞 MRC-5悬液浓度为IO6个/ml，所述一级生物反应器培养的工作体积约10L，所述的放大比例为前一级生物反应器工作体积的20倍。进一步的技术方案是，所述步骤四收获病毒培养液的方式为间隔式收本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵志鹏，侯文礼，
申请(专利权)人：成都康华生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：