一种新城疫的DNA疫苗及其用途制造技术

一种新城疫的ＤＮＡ疫苗，该疫苗由ＮＤＶ－ＬａｓｏｔａＦ基因和真核表达载体ｐＶＡＸ１组成，其特征在于：所述的ＮＤＶ－ＬａｓｏｔａＦ基因是ＮＤＶ病毒的致病决定基因，其为ＮＤＶ病毒的Ｌａｓｏｔａ　　Ｅ↓［４］基因中第４５４１至６２２３的核苷酸，具有图１中所示的核苷酸序列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新城疫的DNA疫苗，特别是涉及一种新城疫病毒PVAX1-LasotaFDNA疫苗，及其用途。
技术介绍
鸡新城疫，也称新城疫病毒(Newcastle disease virus，以下简称NDV)为致病原，目前在世界范围内广泛存在，它是危害世界养鸡业的重要传染病之一，是集约化养鸡场和广大农村养禽业发展的重要制约因素。资料统计证实，速发型NDV是许多发展中国家农村鸡群中流行的NDV病毒株。本病特点为来势迅猛，发病率几乎是100％，死亡率达80％以上，一般每隔四、五年会发生一次全球性大流行。NDV的流行常导致巨大的经济损失，为此全世界都在为控制和消灭NDV而努力。鸡被NDV病毒感染后，目前尚无特殊治疗药物，现在大多采用传统接种NDV病毒减毒活苗或灭活菌作为预防疫苗，雏鸡疫苗接种是预防的主要措施。但是NDV病毒容易变异，从而产生免疫逃避，这是无法控制该病，造成NDV流行的主要原因之一。根据抗原成分不同，可将疫苗分为减毒活苗疫苗、灭活菌疫苗以及重组疫苗。与当前常用的减毒活苗或灭活菌疫苗相比，重组疫苗，即DNA疫苗具有明显的优势1)所需的免疫量较小，20～100微克即可；2)DNA疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更强；3)不仅具有预防疾病的作用而且还有治疗疾病功效；4)基因免疫安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定、操作便捷。因此DNA疫苗具有其它免疫方法难以比拟的潜在优势。其应用前景十分诱人。在针对新城疫病毒(NDV)开发的多种NDV病毒DNA疫苗的工作中，德国的Meszsaros利用NDV-6/10病毒变异株构建的疫苗通过喷雾接种在鸡体中产生了强烈的能抵抗NDV感染的细胞免疫，但检测不到体液免疫的存在，而且采用直接喷雾接种DNA疫苗虽可产生粘膜免疫，但免疫效果远不如肌肉微量注射效果佳。构建一种既能产生高滴度的抗体又能激活细胞免疫的DNA疫苗，筛选具有抗原活性蛋白基因是至关重要的。NDV病毒的F蛋白是NDV致病的分子决定蛋白，其F蛋白裂解位点氨基酸序列决定了NDV病毒致病能力。由一种类胰酶介导的特异性裂解导致融合蛋白F0分裂产生有活性的F1和F2多肽，F1多肽与宿主细胞发生融合作用，从而感染机体细胞。因此通过激发针对F蛋白的有效免疫应答，就有可能达到防治鸡新城疫疾病的目的。比利时的Letellier利用NDV-F蛋白基因制备的病毒重组疫苗能激发高滴度的体液免疫并能抵抗NDV的感染，但抗体并不能较好地发挥中和NDV病毒的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术NDV病毒DNA疫苗不能同时激发体液免疫、免疫效果差、及产生的抗体中和NDV病毒的能力弱的缺陷，从而提供一种能预防和治疗新城疫的pVAX1-LasotaF DNA疫苗，该疫苗选择的是Lasota E4的F蛋白的全基因序列，既包含高度保守的同源序列，又含有抗原决定簇基因序列，此外，其真核表达载体pVAX1和pcDNA3.1均是近年不断完善的载体质粒，因而可以同时激发细胞免疫和体液免疫，而且免疫效果好。本专利技术的另一目的是提供该新城疫的DNA疫苗的构建。本专利技术的再一目的是提供该新城疫的DNA疫苗的用途。本专利技术的目的是由如下的技术方案实现的本专利技术提供一种新城疫的DNA疫苗，该疫苗由NDV-LasotaF基因和真核表达载体pVAX1组成，其特征在于所述的NDV-LasotaF基因是NDV病毒的致病决定基因，其为NDV病毒的Lasota E4基因中第4541至6223的核苷酸，具有图1中所示的核酸序列。本专利技术提供一种所述新城疫DNA疫苗的构建，包括如下步骤1)NDV Lasota病毒总RNA的提取及纯化将NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的鸡胚里面，待鸡胚死亡后，收集尿囊液，按常规方法提取NDV Lasota病毒总RNA；2)设计特异性引物根据Lasota病毒F蛋白基因序列分析设计出一对特异性引物，上游引物5′-AAGATGGGCTCCAGACCTTCTACC-3′；下游引物5′-CCTTCGTTCCTCATCTGTGTTCAC-3′；3)通过温度降落过逆转录-聚合酶链式扩增方法，克隆得到NDV LasotaF的全长cDNA基因序列；4)步骤3)扩增的LasotaF，利用WizardPCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化LasotaF cDNA片段；5)将LasotaF全长cDNA片段重组到PCR3.1真核表达质粒中，构建成一种新城疫DNA疫苗——抗NDV的pVAX1-LasotaF DNA疫苗。所述步骤3)的温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法包括逆转录反应在48℃反应45分钟，接着在95℃灭活5分钟，并启动温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法扩增反应在第一个变性步骤时加入聚合酶，变性温度为94℃，持续1分钟，退火温度从68℃开始，持续1分钟，然后以每四个循环下降1℃的速度降至56℃，持续1分钟，延伸温度为68℃，持续1.5分钟；最后在以退火温度58℃/分钟继续扩增15个循环；最后在72℃延伸10分钟。所述步骤5)中的真核表达载体还可以是pcDNA3.1。本专利技术进一步提供了所述新城疫DNA疫苗在制备用于预防鸡新城疫疾药物中的用途。本专利技术还提供了所述新城疫DNA疫苗在制备用于治疗鸡新城疫疾病药物中的用途。本专利技术提供的新城疫DNA疫苗优益之处在于1)有高效预防和治疗鸡新城疫疾病效的效果；2)所需的免疫量较小，20～50微克即可；3)核酸疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更强；4)基因免疫安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定、操作便捷。附图说明图1为NDV-LasotaF基因的核苷酸序列。具体实施例方式本专利技术实施例中使用的三黄鸡由北京昌平养鸡厂孵育，来杭鸡为北京动物实验中心孵育。实施例1.本专利技术的新城疫DNA疫苗—pVAX1-LasotaF DNA疫苗的构建本专利技术的pVAX1-LasotaF DNA疫苗的构建步骤如下1)NDV病毒(Virus)总RNA的提取及纯化采用Promega公司RNAgentsTotal RNA Isolation System kit提取NDV Lasota病毒总RNA，其具体操作是将由北京中国兽医药品监察所提供的NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的鸡胚里面，在灯光下观察发现鸡胚死亡后，收集尿囊液20ml，将收集的尿囊液以700rpm的速度离心15分钟；将上清液加入20ml 16wt％PEG-0.525M NaCl，冰浴1小时；以10000rpm的速度离心5分钟，于4℃沉淀病毒颗粒；用800μl变性液将病毒沉淀溶解，移至1.5ml EP管；加80μl乙酸钠混匀，加入800μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比1∶1∶1)混匀，振动8～12秒，水浴15分钟；以10000rpm的速度于4℃离心15分钟，取出上清液；以10000rpm的速度于4℃离心10分钟；分出沉淀，干燥后加10μl无核酸酶水，-80℃保存；2)设计特异性引物根据Lasota病毒F蛋白基因序列分析设计出一对特异性引物，上游引物5′-AAGATGGGCTCCAGACCTTCTACC-3′；下游引物5′-CCTTCGTTCCTCATCTGTGTTCAC-3′；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭景楩，陈云，王茂田，王金玲，杨颖，孙泉红，
申请(专利权)人：沧州市兴济动物药厂，中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：