制造疫苗的方法技术

本发明专利技术系关于一种制造对抗产生ＡＢ毒素之细菌病原体，如梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）之疫苗的方法，其包括（ａ）在产生该ＡＢ毒素的条件下培养该病原体，并收获该培养物，（ｂ）于活体外使该ＡＢ毒素经酶裂解，较佳使用六磷酸肌醇作为辅助因子，及（ｃ）将步骤（ｂ）之组合物与医药上可接受的载体组合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术系关于一种，及由此制造之疫苗。
技术介绍
艰难梭菌(Clostridium difficile)系一种会形成孢子的革兰氏阴性菌，其引起 60%之与抗生素相关的腹泻病例，及几乎100%罹患伪膜性结肠炎的病患。引起该疾病爆发的机制尚未充分了解。其可能同时与宿主及菌株因素相关，因为并非所有感染艰难梭菌的病患均发展为疾病。感染病患之临床症状范围可从无症状至危及生命的毒性巨结肠。艰难梭菌如同多种引起包括人类之动物疾病的其它病原体，会产生毒素。毒素系由活细胞或生物体产生的毒性物质，其在非常低的浓度下即具活性。毒素可系小分子类、肽类、或蛋白质，当接触或与生物性大分子，如酶或细胞受体交互作用而被人体组织吸收时， 可以引起疾病。艰难梭菌产生两种毒素，毒素A(TcdA)与毒素B (TcdB)，其引起与抗生素相关的腹泻或伪膜性结肠炎。它们系非常大的(3081^^与沈91^幻细菌蛋白质，连同索氏梭菌 (C. sordellii)之TcsH与TcsL及诺氏梭菌(C. novyi)之Ten α共同属于所谓的大梭菌细胞毒素(LCT)家族之一部分。所有该等毒素均显示高度序列同源性、类似之域结构且含有糖基转移酶部分。TcdA与TcdB系特征为三重功能组织的单链蛋白质。其等之C末端结构域系与目标细胞的质膜结合所需要的，疏水性中间部分为推断的转位域，且该等蛋白质之N 末端催化结构域承载该糖基转移酶位置。尚未充分了解吸收进入该目标细胞的胞液之过程。然而，通常认为该等毒素在与细胞表面受体结合后被吞噬。在内涵体酸化后，只有该毒素之N末端结构域转位进入该胞液中。推断该转位过程系藉由形成微孔所介导，因为TcdA 可在低PH在人工膜上形成微孔。该毒素之活化需要在氨基酸Leu543与Gly544之间进行蛋白质水解而断裂，其释放含有该N末端催化结构域之63kDa小片段至该胞液中。TcdB之较大的207kDa C末端部分仍留在膜部分中。N末端63kDa片段展现完整细胞毒性活性。一旦释放，该N末端糖基转移酶结构域即可在该胞液中自由移动，以灭活其目标蛋白质Aho/ Rac家族之GTP酶。该等蛋白质参与多种细胞功能，例如，肌动蛋白细胞骨架之组织架构、转录控制、细胞极性及增殖。由于Mio GTP酶在免疫系统的多种功能中有重要作用，包括病原体防御反应、细胞因子表达及免疫细胞的信号传导，所以它们构成细菌毒素的最佳目标。最近已显示艰难梭菌毒素之活化系藉由自身催化裂解发生(Reineke等人， Nature 2007,446:415-419)。此外，已阐明六磷酸肌醇 Gns6P、IP6，CASnumber) 的作用系毒素B之自身催化裂解之有效活化剂及辅助因子(Reineke等人，如上述文献)。此高度带电荷的分子似乎履行多种功能及可能参与该毒素之构象的稳定化。现已知毒素透过自身催化裂解而活化之作用亦发生在其它生物体的类似毒素，包括艰难梭菌之LCT毒素A(TcdA)及B (TcdB)、索氏梭菌之致命(TcsL)及出血毒素(TcsH)、及诺氏梭菌之α-毒素(Tcna )、以下各者之RTX毒素霍乱弧菌(Vibrio cholerae) (VcRTX)、 创伤弧菌(V. vulnificus) (VvRtx)、灿烂弧菌(V. splendidus) (VsRtx)、嗜线虫致病杆菌 (Xenorhabdus nematophila) (XnRtx)、伯氏致病杆菌(X. bovienii) (XbRtx)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis) (YpRtx)、莫氏耳口尔森氏菌(Y. mollaretti)(YmMfp2)及百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis) (FhaLl-4) (Sheahan KL 等人， EMBO J 2007,26(10) :2552-2561)、鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)、发光光杆菌(Photorhabdus luminescens)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica) (Lupardus PJ 等人，SCIENCE 2008,322(5899) 265-268)。下文中所有该等毒素可归类为“AB毒素”。国际专利申请案W02008014733揭示一种治疗梭菌感染之方法，其中对病患投与该自身催化活性之抑制剂或活化剂(IP6)。多种公开案揭示艰难梭菌疫苗。其中藉由化学药剂福尔马林灭活TcdA及 TcdB 之疫苗揭示于 Sougioultzis S. L.等人，Gastroenterology (2005), 128 :764-770, Kotloff，Infect. Immun. 2001、W09920304、及 Ghose 等人，Infect. Immun. (2007)，75 (6)， 2826-2832中。包括重组表达的呈现TcdA或TcdB之C末端配体结构域之多肽之疫苗揭示于 W09859053、W0006176U W00061762, W09702836、Pavliakova 等人之 hfect Immun (2000)， 68 (4)，2161-2166,Ward 等人之 Infect Immun (1999)，67 (10)，5124-5132、及 Lyerly 等人之 CurrentMicrobiol 21 :29-32)中。W02007146139 揭示一种编码 iTcdA 及 iTcdB 之受体结合性结构域之密码子最适化的DNA分子及其用作DNA疫苗。W02004041857揭示TcdB之无毒突变体及其用于接种之用途。Genth, H.等人，Infect. Immun. (2000),68 :1094-1101揭示一种用于产生酶解缺陷之艰难梭菌毒素B作为免疫抗原之方法。疫苗之典型制法为制造一种包括此等病原体之抗原组分之制剂，及将其与医药上可接受的载体混合。为获得有效的免疫反应及基于经济原因，需要采用仅需少数几个处理或分馏步骤即可自细菌培养物获得之制剂。在产生毒素的生物体情况下，其问题在于包含于此等制剂中之毒素除非已灭活，否则应避免投药。因此，先前技术方法已建议藉由该等毒素的化学灭活法、该等毒素之无毒性结构域之重组表达法(C末端受体结合性或“B”结构域)、或制备该等毒素之无毒性突变体，以制造对抗产生AB毒素之细菌病原体，如艰难梭菌之疫苗。然而，所有该等措施导致该病原生物体之抗原表位损失，可能影响该疫苗之有效性，及/或耗费成本。专利技术概述本专利技术系关于一种制造对抗产生AB毒素之细菌病原体之疫苗的方法，其包括(a)在可产生该AB毒素的条件下培养该病原体，并收获该培养物；(b)于活体外使该AB毒素经酶裂解；及(c)将步骤(b)之组合物与医药上可接受的载体组合。在较佳态样中，该酶裂解系自身催化的。在较佳态样中，使用磷酸肌醇，较佳六磷酸肌醇，作为该酶裂解之辅助因子。在其它较佳态样中，本专利技术系关于一种如所述之方法，其中该等细胞系在收获后， 自该培养基分离，且裂解该培养基中之AB毒素。本专利技术方法可用于制备对抗以下病原体之疫苗梭菌属(Clostridium本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种制造对抗产生ＡＢ毒素的细菌病原体之疫苗的方法，其包括：（ａ）在产生该ＡＢ毒素的条件下培养该病原体，并收获该培养物；（ｂ）于活体外使该ＡＢ毒素经酶裂解；及（ｃ）将步骤（ｂ）之组合物与医药上可接受的载体组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰西卡·赖内克，
申请(专利权)人：贝林格尔英格海姆维特梅迪卡有限公司，
类型：发明
国别省市：DE