一种新城疫DNA疫苗及其构建和应用制造技术

一种新城疫ＤＮＡ疫苗，该疫苗由ＮＤＶ－ＬａｓｏｔａＨＮ基因和真核表达载体ｐＶＡＸ１组成，其特征在于：所述的ＮＤＶ－ＬａｓｏｔａＨＮ基因是ＮＤＶ病毒的致病决定基因，其为ＮＤＶ病毒的Ｌａｓｏｔａ　　Ｅ↓［４］基因中第６４００至８１４４的核苷酸，具有图１中所示的核苷酸序列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA疫苗及其构建和应用，特别是涉及一种新城疫病毒pVAX1-LasotaHN DNA疫苗及其构建和应用。
技术介绍
1990年Dr.John Woffer和Dr.Feigner偶然发现，质粒DNA在肌肉细胞中能进行转化和表达，并推测用DNA注入机体可能产生免疫反应。1992年美国的Robinson实验室、Johoston实验室、David实验室同时开发研究出了DNA疫苗的雏形，并在1992年9月召开的疫苗学新进展大会上同时进行了报告。1992年Tang在Nature上报导，将含有人生长激素基因的质粒DNA导入小鼠，在小鼠血清中检测到特异抗人生长激素抗体，DNA疫苗的新技术自此问世，并且立刻引起世界各国的高度重视，被人们视为疫苗研究领域的一场革命。1994年美国国家卫生研究院(NIH)以国家生物战略发展计划的专项经费资助开展DNA疫苗治疗HIV的研究工作。1994年美国FDA批准了在人体进行DNA疫苗治疗爱滋病的临床试验。1995年5月，报导了世界第一例DNA疫苗的临床试验，世界卫生组织(WHO)拨款把DNA疫苗纳入WHO全球免疫研制开发计划之中。DNA疫苗新技术的核心是将编码抗原的核酸序列组装到含有必要表达调控元件的真核表达载体中构建核酸疫苗，然后将其导入动物体内，重组的核酸疫苗可以利用动物体内的酶系合成外源基因编码的蛋白，从而诱发动物对该外源蛋白产生免疫应答，达到免疫目的。许多动物模型和人体实验都证明了DNA疫苗能激发有效的体液免疫应答和细胞免疫应答既可激活体液免疫，又能激活细胞免疫，这表明DNA免疫技术，不仅能通过产生抗体预防病毒感染，更重要的是DNA疫苗可诱导极有效的专一性T杀伤细胞的能力，清除已经被感染的机体细胞，达到治疗疾病的目的，而且没有副作用反应。与当前常用的减毒活苗疫苗或灭活菌疫苗相比，DNA疫苗具有明显的优势，1)所需的免疫量较小，20-100微克；2)DNA疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更强；3)不仅具有预防疾病的作用而且还有治疗疾病功效；4)基因免疫安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定、操作便捷。因此DNA疫苗具有其它免疫方法难以比拟的潜在优势。其应用前景十分诱人。鸡新城疫，也称新城疫病毒(Newcastle disease virus，以下简称NDV)是国内外养禽业发展的重要制约因素。速发型新城疫病毒(NDV)是鸡群中流行的新城疫病毒毒株。当前，NDV是危害世界养鸡业、养鸽业的重要传染病之一。鸡感染新城疫病毒后，目前尚无特殊治疗药物。雏鸡疫苗接种是预防的主要措施，目前一般采用的是新城疫病毒减毒活苗或灭活苗作预防疫苗。这种减毒疫苗虽有一定效果，但工艺繁琐，效果差，每当新城疫病毒流行，鸡的死亡率仍是非常之高。此外，这种减毒活苗或灭活苗仅能激活体液免疫，所以只在预防上有一定作用，但无法控制和治疗该病毒引起的鸡瘟。不能满足国内外养禽业急需具有高效、安全可靠、有预防作用的鸡新城疫疫苗的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有传统接种NDV病毒减毒活苗或灭活菌作为预防疫苗，产生的抗体滴度低、免疫效果差、易产生免疫逃避、仅有较弱的预防作用而无治疗新城疫的功能等缺陷，从而提供一种能预防和治疗新城疫pVAX1-LasotaHN DNA疫苗。本专利技术的另一目的是提供该新城疫DNA疫苗的构建。本专利技术的再一目的是提供该新城疫DNA疫苗的用途。本专利技术的目的是由如下的技术方案实现的本专利技术提供的新城疫DNA疫苗，该疫苗由NDV-LasotaHN基因和真核表达载体pVAX1组成，其特征在于所述的NDV-LasotaHN基因是NDV病毒的致病决定基因，其为NDV病毒的Lasota E4基因中第6400至8144的核苷酸，具有图1中所示的核苷酸序列本专利技术提供的所述新城疫DNA疫苗的构建，包括如下步骤1)NDV Lasota病毒总RNA的提取及纯化将NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的鸡胚里面，待鸡胚死亡后，收集尿囊液，按常规方法提取NDV Lasota病毒总RNA；2)设计特异性引物根据Lasota病毒F蛋白基因序列分析设计出一对特异性引物，上游引物5′-CGACAACAGTCCTCAATCATGG-3′；下游引物5′-TTGACTCAACTAGCCAGACCTGG-3′；3)通过温度降落过逆转录-聚合酶链式扩增方法，克隆得到NDV Lasota HN的全长cDNA基因序列； 4)将步骤3)扩增的LasotaHN，利用WizardPCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化LasotaHN cDNA片段；5)将LasotaHN全长cDNA片段重组到pVAX1真核表达质粒中，构建成一种新城疫DNA疫苗——抗NDV的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗。所述步骤3)的温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法包括逆转录反应在48℃反应45分钟，接着在94℃灭活5分钟，并启动温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法扩增反应在第一个变性步骤时加入聚合酶，变性温度为94℃，持续1分钟，退火温度从68℃开始，持续1分钟，然后以每四个循环下降1℃的速度降至56℃，持续1分钟，延伸温度为65℃，持续1.5分钟；最后在以退火温度57℃/分钟继续扩增15个循环；最后在71℃延伸10分钟。本专利技术进一步提供了所述新城疫DNA疫苗在制备用于预防鸡新城疫疾药物中的应用。本专利技术还提供了所述新城疫DNA疫苗在制备用于治疗鸡新城疫疾病药物中的应用。本专利技术提供的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗优益之处在于1)所需的免疫量较小，20～50微克即可；2)核酸疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更强；3)不仅具有预防鸡新城疫疾病的作用而且还有治疗该疾病功效；4)基因免疫安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定、操作便捷。附图说明图1为NDV-LasotaHN基因的核苷酸序列。具体实施例方式本专利技术实施例中使用的三黄鸡由北京昌平养鸡厂孵育，来杭鸡为北京动物实验中心孵育。实施例1.本专利技术的新城疫DNA疫苗——pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的构建本专利技术的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的构建步骤如下1)NDV病毒(Virus)总RNA的提取及纯化 采用Promega公司RNAgentsTotal RNA Isolation System kit提取NDV Lasota病毒总RNA，其具体操作是将由北京中国兽医药品监察所提供的NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的鸡胚里面，在灯光下观察发现鸡胚死亡后，收集尿囊液20ml，将收集的尿囊液以700rpm的速度离心15分钟；将上清液加入20ml 16wt％PEG-0.525MNaCl，冰浴1小时；以10000rpm的速度离心5分钟，于4℃沉淀病毒颗粒；用800μl变性液将病毒沉淀溶解，移至1.5ml EP管；加80μl乙酸钠混匀，加入800μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比1∶1∶1)混匀，振动8～12秒，水浴15分钟；以10000rpm的速度于4℃离心15分钟，取出上清液；以10000rpm的速度于4℃离心10分钟；分出沉淀，干燥后加10μl无核酸酶水，-80℃保存；2)设计特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭景楩，陈云，杨颖，孙泉红，王金玲，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：