克力托辛在制备抗肿瘤多药耐药性药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供克力托辛在制备抗肿瘤多药耐药性的药物中的应用，所述克力托辛的分子式为Ｃ↓［９］Ｈ↓［１３］Ｎ↓［５］Ｏ↓［６］，分子量２８７，所述药物由克力托辛与制剂允许的药物赋形剂或载体组成，制剂形式是液体制剂或固体制剂。本发明专利技术提供的药物对多药耐药肿瘤细胞的杀伤作用明显优于紫杉醇，阿霉素，顺铂等临床常用药，克力托辛杀死高表达Ｐ－糖蛋白肿瘤细胞的机理是抑制Ｐ－糖蛋白的功能并诱导细胞凋亡，与其亲本药敏细胞一致，具有很好的制备抗肿瘤多药耐药性药物的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属制药
，涉及克力托辛在制备抗肿瘤多药耐药性药物中的 应用。
技术介绍
肿瘤化疗是治疗肿瘤的一种基本手段，但肿瘤化疗的效果会因为肿瘤细胞获得抗药性而失败，多药耐药(multiple drug resistance MDR)指肿瘤细胞对不 同结构和作用机理的多种药物产生交叉耐药性，是化疗失败的主要原因。MDR 的产生机制复杂，其中一个原因与MDR1基因编码产物--ATP能量依赖性药 物外排泵P-糖蛋白(P-glycoprotein， P-gp)过度表达有关，致使药物外排增加， 细胞内药物浓度减少；此外，也与细胞凋亡过程有关，缺失凋亡蛋白Bax或过 表达抗凋亡蛋白Bcl-2均会导致某些肿瘤细胞产生多药耐药性。目前临床上使用的抗癌药物，阿霉素，表阿霉素，丝裂霉素，柔红霉素， 紫杉醇，长春新碱，顺铂等，均为P-糖蛋白的底物，为耐药肿瘤细胞所抗，因 此，当肿瘤细胞内P-gp高表达后，肿瘤细胞获得的抗药性，并不针对一种抗 癌药，而是对多种抗癌药，即多药耐药，要增加P-gp高表达肿瘤细胞对药物 的敏感性，最有效的办法就是抑制这种蛋白的功能，使其不能发挥药泵作用， 并增强肿瘤细胞的凋亡，因此研制抑制这种蛋白功能的药物对肿瘤的化疗有重 要意义，目前临床上还没有一种针对P-gp的药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供克力托辛(clitocine)在制备抗肿瘤多药耐药性的药 物中的应用，该clitocine是从高等真菌大白桩燕菌(丄ewco/ oxz7/w 子实体中分离所得，分子式为C9H13N506，分子量287。所述药物由克力托辛 与制剂允许的药物赋形剂或载体组成。本专利技术所述的高等真菌大白桩菇菌 awC0;7axZ//W<$g/gaw^^)属白蘑科，夏秋季于草原上单生或群生，有时生于 林中草地上。分布于河北、内蒙古、吉林、辽宁、山西、黑龙江、青海、新疆 等地。本专利技术提供的药物，其制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、 软胶丸、软胶囊、滴丸剂或注射剂。本专利技术提供的药物，制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。 克力托辛对多药耐药肿瘤细胞的杀伤作用明显优于紫杉醇，阿霉素，顺铂 等临床常用药，克力托辛杀死高表达P-糖蛋白肿瘤细胞的机理是抑制P-糖蛋白 的功能并诱导细胞凋亡，与其亲本药敏细胞一致，目前临床上缺乏能逆转肿瘤 多药耐药性的药物，因此克力托辛具有很好的制备抗肿瘤多药耐药性药物的应 用前景。 附图说明图1是克力托辛的液相色谱分析。图2是耐药肿瘤细胞及亲本药敏细胞的P-糖蛋白表达量比较。图3是不同浓度克力托辛抑制HepG2和R-HepG2体外增殖比较。图4是克力托辛诱导HepG2和R-HepG2细胞产生DNA梯状条带的凝胶电泳比较图。图5是克力托辛诱导HepG2和R-HepG2细胞凋亡的AnnexinV-PI双染凋亡比 较图。图6是克力托辛诱导HepG2和R-HepG2细胞线粒体膜电位变化的JC-1染色比 较图。图7是克力托辛诱导HepG2和R-HepG2细胞释放细胞色素c的免疫印迹比较。 图8是Caspase-8抑制剂逆转克力托辛诱导的HepG2和R-HepG2凋亡作用比 较图。图9是Caspase-9抑制剂逆转克力托辛诱导的HepG2和R-HepG2凋亡作用比 较图。图10是克力托辛抑制R-HepG2的P-糖蛋白表达免疫印迹图。 图11是克力托辛部分逆转R-HepG2对阿霉素的抗药性。 具体实施例方式以下将结合具体实施例与附图详细说明本专利技术，这些实例仅用于说明目的， 而不用于限制本专利技术范围。实施例一从新鲜大白桩菇菌子实体提取分离纯化抗肿瘤活性化合物及其 结构鉴定 实验方法l.提取和纯化将原料新鲜大白桩菇菌子实体(2.7kg)真空冷冻干燥，粉碎 机粉碎，所得340g菌粉浸于1.5L95% (v/v)酒精中，其间更换新鲜溶剂一次， 合并两次浸提液，减压浓縮得酒精浸膏(25.7g)，浸膏经乙酸乙酯萃取，减压浓縮得乙酸乙酯浸膏(15.7g)。取15g乙酸乙酯浸膏上硅胶柱，CH2Cl2/MeOH(10:0-0:10)梯度洗脱，收集细胞筛选有活性的洗脱峰(6.5g)，然后上反相株RP-18(ODS, 50pm， 025x420 mm)， MeOH/H20 (1:9)洗脱，细胞筛选有活性的部分再经过 反相株RP-C8制备[5 020x250 mm; MeOH/H20 (5:95); 8 ml/min]，得到目的 化合物克力托辛(815mg)。其液相色谱分析图参见附图1，在洗脱时间9.0分时 出现单一峰即为克力托辛。2. 结构鉴定核磁共振仪(INOVA-400)，质谱仪(Bruker Esquire 3000 plus)3. 实验结果克力托辛，分子式为C9H13N506， ESI-MS: m/z 287。其一维的二维的核磁数据列于表1，根据这些数据与文献比较所得克力托辛的化学结 构<formula>formula see original document page 5</formula>表1克力托辛的核磁数据<table>complex table see original document page 5</column></row><table>C3'70.4 (d)71.7(d)4.09 (1H, t, 9.83)3.94 (1H, t, 9.98)C4'84.4 (d)83.6 (d)3.81 (lH，dd, 3.11,6.98)3.82 (1H, dd, 4.60,8.64)C5'60.9 (t)62.0 (t)3.46 (2H， dd, 5.16, 10.45)3,44 (2H, dd， 6.80, 11.55)N49.30 (1H， d, 7.52)9.9680 (1H， d, 8.45)N68.57 (2H, brs)8.60 (2H, brs)02'5.23 (1H， brs)5.64(m,brs)03'5.08 (1H， brs)5.26 (1H, brs)05'4.78 (1H, brs)4.77(1H,brs)实施例二肝癌HepG2细胞和R-HepG2对临床抗肿瘤药的敏感性及P-糖 蛋白表达量的比较 实验材料和方法肝癌细胞HepG2购自美国American Type Culture Collection,耐药细胞 R-HepG2的建立，系由HepG2加抗癌药物阿霉素培养，存活下来的细胞继续 添加较高浓度的阿霉素继代培养，不断培养一段时间后，挑选抗药性克隆建系 即R-HepG2。两株细胞均培养在DMEM培养基(Invitrogene)，添加5%小牛血清 (Invitrogene)， 2mM谷氨酰胺，37°C， 10%0)2培养箱。四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测药物对肿瘤细胞增殖的影响选择 对数生长期细胞，以1><104的密度接种于96孔板中，置37C， 10%培养箱中 培养4小时后加入不同浓度的药物，每个浓度设复孔6个，培养48小时，吸 出孔板中培养液，往每孔中加入浓度为lmg/ml的MTT50^，放入培养箱中继 续培养4小时，取出加过MTT的96孔板，每孔加入150|il的DMSO，轻本文档来自技高网...

【技术保护点】
克力托辛在制备抗肿瘤多药耐药性的药物中的应用，所述克力托辛的分子式为Ｃ↓［９］Ｈ↓［１３］Ｎ↓［５］Ｏ↓［６］，分子量２８７，所述药物由克力托辛与制剂允许的药物赋形剂或载体组成。

【技术特征摘要】
1.克力托辛在制备抗肿瘤多药耐药性的药物中的应用，所述克力托辛的分子式为C9H13N5O6，分子量287，所述药物由克力托辛与制剂允许的药物赋形剂或载体组成。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘非燕，郭添德，吴世华，吴平，冯国培，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]