抗肿瘤组合物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗肿瘤组合物及其制备方法，该组合物由氨基酸序列在ＮＣＢＩ数据库中登录号分别为Ｇｉ　２１４８１６９、Ｇｉ　１１４２３６、Ｇｉ　８１０１７４２、Ｇｉ　２１４８１７５、Ｇｉ　１５７６７４４６３、Ｇｉ　５０５５２９、Ｇｉ　１５７６９０６９４、Ｇｉ　１１６２４８３２２、Ｇｉ　１５６６０３５０４、Ｇｉ　８９８０６２１的蛋白ａ、蛋白ｂ、蛋白ｃ、蛋白ｄ、蛋白ｅ、蛋白ｆ、蛋白ｇ、蛋白ｈ、蛋白ｉ、蛋白ｊ组成。本发明专利技术组合物对多种癌细胞均有抑制作用，制备方法简单，具有较好的市场化前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤治疗领域，尤其涉及一种。
技术介绍
大头金蝇(Chrysomyia megacephala)，别名红头苍蝇，是节肢动物门有颚亚门昆 虫纲有翅亚纲双翅目丽蝇科金蝇亚科昆虫的一种。它食物转化率高，生长速度快，繁殖力 高，产卵期长，其虫体的蛋白质含量高，饲养条件和养殖设备相对简单，有利于大规模生产。大头金蝇是一种完全变态的昆虫，生活史包括卵一幼虫一蛹一成蝇4个阶段。大 头金蝇卵为淡黄色，呈香蕉型，长度约一毫米，一克卵大约有7000粒。幼虫呈锥形，前端尖， 后端钝圆，有明显的体节，体长为13 16毫米，一克幼虫约有15条，在适宜的温度环境下， 成熟幼虫1 2天就可以成蛹，蛹经过5天左右，即可羽化出成虫。成虫体长8 11毫米， 金属绿色，身被灰色，复眼红色。CN101032525A公开了 一种从蝇蛆提取分离具有体外抗肿瘤作用的有效组分，该组 份从外源物质诱导的蝇蛆中提取、分离获得，具有抑制人原髓细胞白血病HL-60和人肺腺 癌A549细胞增殖生长的作用，当受试物浓度为250MG/ML时，外源物质诱导的蝇蛆干粉及其 不饱和脂肪酸体外抑制人原髓细胞白血病HL-60增殖生长的效果分别为25. 5 %与96. 2 %， 抑制人肺腺癌A549细胞增殖生长的效果分别为26. 8%与97. 0%。该组合物由不饱和脂肪 酸组成，未明确予以定量，成分复杂，保存过程中易氧化，对其进行活性测试的剂量较大，疗 效欠佳。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗肿瘤组合物，该组合物对多种肿瘤细胞均有较强的抑制活 性。一种抗肿瘤组合物，由氨基酸序列在NCBI (美国国立生物技术信息中心)数据 库中登录号分别为 Gi 2148169、Gi 114236、Gi 8101742、Gi2148175、Gi 157674463、Gi 505529,Gi 157690694,Gi 116248322、Gil56603504、Gi 8980621 的蛋白 a、蛋白 b、蛋白 c、 蛋白d、蛋白e、蛋白f、蛋白g、蛋白h、蛋白i、蛋白j组成。优选的，所述的抗肿瘤组合物重量百分比组成为蛋白a 20 25%、蛋白b 20 25%、蛋白c 1 5%、蛋白d 15 20%、蛋白e 5 10%、蛋白f 10 15%、蛋白g 10 15%、蛋白h 1 5%、蛋白il 5%、蛋白j 1 5%。更优选的，所述的抗肿瘤组合物重量百分比组成为蛋白a 20 22%、蛋白b 20 22%、蛋白c 2 5%、蛋白d 15 18%、蛋白e 5 7%、蛋白Π0 12%、蛋白g 10 12%、蛋白h 1 3%、蛋白i 1 3%、蛋白j 1 3%。最优选的，所述的抗肿瘤组合物重量百分比组成为蛋白a 21. 97%、蛋白b 21.59%、蛋白 c 3. 88%、蛋白 d 17. %、蛋白 e 5. 85%、蛋白 Π0. 82%、蛋白 g 10. 95%, 蛋白 h 2. 19%、蛋白 i 2. 74%、蛋白 j 2. 75%。本专利技术还提供了一种上述抗肿瘤组合物的制备方法，包括(1)将大头金蝇消毒后驯化2代以上，得到种蝇；(2)培养基置于培养箱内发酵3 5小时后，将种蝇放入培养箱内产卵，控制培养 箱内氨气浓度为50 200ppm，卵孵化后，控制培养箱内温度沈 35°C，氨气浓度为500 lOOOppm，继续培养M 120小时；(3)将幼虫清洗干净，冷冻干燥、粉碎，溶于水中，在1 15°C浸提30 40小时， 10000转/分下离心5分钟，取上清液并进行超滤，去除原料粉末中分子量低于8000KD的组 分，即为成品。卵孵化前，培养箱内一氧化碳浓度小于30ppm，氧气浓度20 50ppm，二氧化碳浓 度 3000 6000ppm。卵孵化后，培养箱内一氧化碳浓度小于lOppm。所述的培养基为青蛙肉、家禽肉、家畜肉、家畜内脏和淡水鱼肉中的一种或多种， 这些基料易获得，成本低廉。所述培养基可以选用以下几种配方(1)10 60%的淡水鱼肉、20 70%猪内脏和10 50%的青蛙肉；(2)30 70%的猪内脏和30 70%的青蛙肉；(3) 10 50%的猪肉和10 50%淡水鱼肉及10 50%鸡肉；(4)20 60%的牛肉和30 70%青蛙肉；(5)30 70%的羊肉、10 50%淡水鱼肉及20 60%猪内脏。本专利技术组合物对多种癌细胞均有抑制作用，制备方法简单，具有较好的市场化前旦ο具体实施例方式实施例1驯化野生大头金蝇取自然界的大头金蝇，为避免野生种类的带菌传病之嫌，经过高猛酸钾消毒处理 后，进行2 3代隔离饲养，然后在接近自然的养蝇房内养殖驯化，经过四代后，种蝇驯化完 成，得到种蝇。如来年不再驯化种蝇，就需要保存种蝇。保种的方法为在9 10月份秋末时，把 蝇蛹放入密封容器内，置于温度为5 10°C的冷藏室内，在该温度下蛹不会死亡也不会孵 化，来年室外温度上升到22°C以上时，取出放进蝇房即可孵化。实施例2培养幼虫将20千克培养基(60%的淡水鱼肉、30%猪内脏和10%的青蛙肉)置于培养箱 内。培养箱体积0. 14立方米，制作材料可使用金属、塑料、木材、水泥、复合材料等，形状为 长方体或正方体，顶面设有一个可调节大小的通气孔。当培养基开始发酵后，将种蝇的卵放 在培养基的表面，并控制培养箱内氨气浓度在50 200ppm，一氧化碳浓度小于30ppm，氧气 浓度20 21ppm，二氧化碳浓度3000 6000ppm，培养大概6个小时左右，卵开始孵化。接着把通气孔孔径减小，增加氨气浓度至500 lOOOppm，一氧化碳浓度降低小于 lOppm，继续培养100小时，得到幼虫。整个过程中，不再加入新鲜的培养基，当气体浓度超 出上述范围，则将通气孔增大，调整到上述范围内。实施例3后处理首先把收集的蝇幼虫活体放置在60目尼龙筛网制成的无盖网箱内，用清水冲洗。 30分钟冲洗一次，连续冲洗四次以上，此方法能将幼虫体内的污物彻底清洗干净，真空冷冻 干燥至含水量10%以下。取出存放于密封容器内，在1 4°C的环境下保存即可。将冻干物粉碎至80目，以水为溶媒，将粉碎物与水按1 10的重量比混合，在温 度10°c下浸泡35小时，取出后用离心机分离，离心转速为10000转/min，离心时间为5分 钟，取上清液，在_35°C以下，低温冷冻干燥成含水量小于8%，得到的为结晶状产物，大致 占幼虫总重量的25 观％。实施例4分离纯化蛋白质将结晶状产物复溶于水配置成重量百分比浓度为50%的溶液，利用分子超滤系统 (法国militon生产)进行超滤，超滤系统参数设置筛选范围8000 80000DK ；压差为2 个大气压；流速500ml/小时；将分子量低于8000DK的小分子物质去除，收集截留物溶于 水，-45°C真空干燥。实施例5定性定量(1)取适量实施例4的冻干物样品，加入裂解液(8M Urea, 1 OmMDTT, 150mM Tris) 约lml，超声(80W)裂解，全过程在冰上完成。离心，12，000g，45分钟，取上清。(2)取上清液使用Bio-fcid protein assay reagent定量，分装成IOug每管，置于 500ul离心管中，低温保存(-800C )。(3)电泳上样 20ug，SDS-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤组合物，由氨基酸序列在ＮＣＢＩ数据库中登录号分别为Ｇｉ　２１４８１６９、Ｇｉ　１１４２３６、Ｇｉ　８１０１７４２、Ｇｉ　２１４８１７５、Ｇｉ　１５７６７４４６３、Ｇｉ５０５５２９、Ｇｉ　１５７６９０６９４、Ｇｉ　１１６２４８３２２、Ｇｉ　１５６６０３５０４、Ｇｉ　８９８０６２１的蛋白ａ、蛋白ｂ、蛋白ｃ、蛋白ｄ、蛋白ｅ、蛋白ｆ、蛋白ｇ、蛋白ｈ、蛋白ｉ、蛋白ｊ组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王正华，
申请(专利权)人：浙江千年春生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：33[]