凝集抑制测定法以及凝集抑制测定用试剂制造技术

本发明专利技术的课题在于提供一种凝集抑制测定法及凝集抑制测 定用试剂，其能够在低浓度区域至高浓度区域高灵敏度且广范 围地测定试样中的配体，同时，还具有良好的测定重复性。本 发明专利技术提供的凝集抑制测定法及凝集抑制测定用试剂，使用负载 有配体的不溶性载体颗粒和游离态的特异性受体、以及负载有 配体上的结合部位与上述游离态的受体不同的特异性受体的不 溶性载体颗粒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种利用(载体)颗粒的凝集抑制反应来测定 试样中的测定对象即配体的方法以及用于该方法的试剂。尤其 涉及预先负载有配体的不溶性载体颗粒、配体特异性的游离态 的受体以及负载有配体特异性受体的不溶性载体颗粒所形成的 凝集被样品中的配体抑制的凝集抑制测定法以及凝集抑制测定 用试剂。
技术介绍
利用不溶性载体颗粒产生颗粒的凝集或者产生凝集抑制， 从而对配体进行定性、定量的测定方法既简单又具有高灵敏度，结合反应等的配体-受体反应原理的各种测定试剂。凝集法是一种测定凝集程度的方法，所述凝集程度是受体 致敏的载体颗粒因对象配体介导的交联反应而凝集的凝集程 度，在需要以高灵敏度测定微量物质的背景下，许多测定项目 已实用化。另 一方面，凝集抑制法是一种测定凝集被测定对象即配体 抑制的比例的方法，所述凝集为事先用配体或者配体样物质致敏的载体颗粒与受体所发生的凝集；凝集法中，除了特殊的配 体外，还必须具备2种以上特异性受体，与此相对，凝集抑制法 最大特征在于只需1种特异性受体即可构建测定体系。此外，就免疫反应来说，凝集抑制法虽具有不会引起钩状 效应(hook effect)(由于抗原过量而造成的表观上的反应减少 的现象)这个优点，但迄今为止的应用中，大部分的场合都以半抗原这样的低分子配体也就是无法利用2种以上受体的配体作为测定对象。作为凝集抑制法应用受限的理由，可举出与凝集法相比测定浓度范围的调整较为困难这一点。凝集法中，由于凝集的进 行与配体量成比例，因此例如涉及胶乳增强免疫凝集法(latex-enhanced immuno-agglutination method) 的专利文献l 所示那样，能够仅通过增强高浓度区域的灵敏度增加，而容易 地扩大测定范围。另 一 方面，关于与配体量成比例地进行凝集抑制反应的凝 集抑制法的测定范围，配体高浓度区域的测定上限值基本上依 赖于初始凝集(配体量为零时的凝集)的大小，配体低浓度区 域的测定下限值依赖于凝集抑制反应的敏感性，因此有必要综 合考虑这两个因素。作为增强凝集抑制法的初始凝集的方法，例如可举出专利 文献2中所述的方法，即在半抗原的测定中利用非特异性的促凝 物质的方法。根据该方法，能够进行直至高浓度区域的配体的 测定，能够扩大测定上限值，但是由于凝集增强是与配体和受 体间的特异反应无关的，因此对凝集抑制反应的敏感性降低， 结果低浓度区域的检测能力显著恶化。另夕卜，专利文献3中示出了利用单一 的单克隆抗体致敏载体 和抗原致敏载体的凝集抑制法。该方法利用了分别负载有配体 和受体的载体颗粒，通过增加光学灵敏度的变化量来提高低浓 度区域的检测能力，且不损害对凝集抑制反应的敏感性。但是 由于该方法并不是增强抗原和抗体间的反应本身，因此看不到 扩大测定范围这一效果。同样，专利文献4提出的利用抗原致敏 胶乳、抗体以及抗体特异性受体的凝集抑制法，其仅通过抗体 和抗原、抗体和受体的特异反应来增强凝集，因此与以往方法相比，可实现扩大测定范围。但是实施例中作为受体示出的蛋白A由于对所有抗体(IgG)都具有反应性，因此在含有IgG的血清或血浆试样的测定中是不适合的，另外，还要考虑到如下情况，即，抗小鼠IgG大鼠单克隆抗体不是通常使用的材料， 有时不易得到。另外还要考虑到测定原理自身是通过抗原-抗 体、抗体-受体这才羊的二相反应(biphasic reaction),因此存在 测定仪器、方法导致性能不良的可能性。如上所述，兼具初始凝集强、且同时对于凝集抑制反应的 敏感性也高这样相反特性的凝集抑制测定法以及凝集抑制测定 用试剂尚未确立，目前的测定法对于通常的配体、例如具有2 个以上受体结合部位的配体而言，处于难以高灵敏度且广范围、 重复性良好地进行测定的困境。专利文献l:日本特开2004-191332号7>才艮专利文献2:日本特公开05-000665号公报专利文献3:日本特开昭59-173760号公报专利文献4:日本特开2001-337092号7>才良
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术是为了解决上述现有技术的问题，其课题在于提供 一种凝集抑制测定法以及一种凝集抑制测定用试剂，其能够在 低浓度区域至高浓度区域高灵每丈度且广范围地测定试样中的配 体，同时还具有良好的测定重复性。用于解决问题的方案本专利技术人等专心致力于凝集抑制测定法的研究，结果发现 通过使用负载有配体的不溶性载体颗粒和游离态的特异性受 体，以及负载有配体上的结合部位不同于上述游离态受体的特异性受体的不溶性载体颗粒，在保持对于凝集抑制反应的敏感 性的同时能够增强初始凝集，而且能够在低浓度区域至高浓度 区域意外地以高灵敏度、广范围地进行测定，同时具有良好的 测定重复性，从而完成了本专利技术。 即，本专利技术包括以下方案。(1 ) 一种凝集抑制测定法，其特征在于，其通过将含有具 有两个以上受体结合部位的测定对象配体的试才羊与下述(A) (c)混合，来测定颗粒的凝集抑制反应，所述凝集抑制反应反映着试样中的测定对象配体的量，(A) 预先负载有配体或者配体样物质的不溶性载体颗粒、(B) 与上述配体特异性反应的游离态受体、(C) 负载有受体的不溶性载体颗粒，所述受体与上述配 体特异性反应、且配体上的结合部位与上述游离态受体不同。(2)根据上述(1 )所述的凝集抑制测定法，其中，不溶 性载体颗粒为胶乳颗粒。(3 )根据上述(1 )或(2)所述的凝集抑制测定法，其中， 受体为抗体或者含有其功能性部位的片段，配体为抗原，基于 受体和配体的免疫反应来测定颗粒的凝集抑制反应。(4) 根据上述(1 ) ~ ( 3 )中任意一项所述的凝集抑制测 定法，其中，游离态受体以及不溶性载体颗粒所负载的受体均 为单克隆抗体。(5) 根据上述(1) ~ ( 4)中任意一项所述的凝集抑制测 定法，其中，测定对象配体为人白蛋白，受体为抗人白蛋白单 克隆抗体。(6) 根据上述(1) ~ (5)中任意一项所述的凝集抑制测 定法，其中，负载有受体的不溶性载体颗粒的平均粒径为负载1/10。(7) —种凝集抑制测定用试剂，其特征在于，含有下述(A) ~(C),来测定颗粒的凝集抑制反应，所述凝集抑制反应反映 着试样中的测定对象配体的量，(A) 预先负载有配体或者配体样物质的不溶性载体颗粒、(B) 与上述配体特异性反应的游离态受体、(C) 负载有受体的不溶性载体颗粒，所述受体与上述配 体特异性反应、且配体上的结合部位与上述游离态受体不同。(8) 根据上述(7)所述的凝集抑制测定用试剂，其中， 不溶性载体颗粒为胶乳颗粒。(9) 根据上述(7)或(8)所述的凝集抑制测定用试剂， 其中，受体为抗体或者含有其功能性部位的片段，配体为抗原， 所述试剂为用于基于受体和配体的免疫反应来测定颗粒的凝集 抑制反应的试剂。(10) 根据上述(7) ~ (9)中任意一项所述的凝集抑制 测定用试剂，其中，游离态受体以及配体上的结合部位不同于 上述游离态受体的受体均为单克隆抗体。(11 )根据上述(7) ~ (10)中任意一项所述的凝集抑制 测定用试剂，其中，负载有受体的不溶性载体颗粒的平均粒径 为负载有配体或者配体样物质的不溶性载体颗粒的平均粒径的 1/2 ~ 1/10。(12)根据上述(7) ~ (本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种凝集抑制测定法，其特征在于，其通过将含有具有两个以上受体结合部位的测定对象配体的试样与下述（Ａ）～（Ｃ）混合，来测定颗粒的凝集抑制反应，所述凝集抑制反应反映着试样中的测定对象配体的量，　（Ａ）预先负载有配体或者配体样物质的不溶性载 体颗粒、　（Ｂ）与上述配体特异性反应的游离态受体、　（Ｃ）负载有受体的不溶性载体颗粒，所述受体与上述配体特异性反应、且配体上的结合部位与上述游离态受体不同。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2006.7.24 JP 200558/20061.一种凝集抑制测定法，其特征在于，其通过将含有具有两个以上受体结合部位的测定对象配体的试样与下述(A)～(C)混合，来测定颗粒的凝集抑制反应，所述凝集抑制反应反映着试样中的测定对象配体的量，(A)预先负载有配体或者配体样物质的不溶性载体颗粒、(B)与上述配体特异性反应的游离态受体、(C)负载有受体的不溶性载体颗粒，所述受体与上述配体特异性反应、且配体上的结合部位与上述游离态受体不同。2. 根据权利要求l所述的凝集抑制测定法，其中，不溶性 载体颗粒为胶乳颗粒。3. 根据权利要求1或2所述的凝集抑制测定法，其中，受体 为抗体或者含有其功能性部位的片段，配体为抗原，基于受体 和配体的免疫反应来测定颗粒的凝集抑制反应。4. 根据权利要求l ~ 3中任意一项所述的凝集抑制测定法， 其中，游离态受体以及不溶性载体颗粒所负载的受体均为单克 隆抗体。5. 根据权利要求l ~ 4中任意一项所述的凝集抑制测定法， 其中，测定对象配体为人白蛋白，受体为抗人白蛋白单克隆抗体。6. 根据权利要求l ~ 5中任意一项所述的凝集抑制测定法， 其中，负载有受体的不溶性载体颗粒的平均粒径为负...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉田忠晃，高桥弘至，
申请(专利权)人：积水医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：JP