作为凝集试剂的合成粒子制造技术

本发明专利技术涉及通过凝集作用检测样本液体中分析物的方法，其中将样本液体与凝集试剂和惰性基质接触，反应混合物受引力作用，测定分析物与凝集试剂之间的反应；其中合成粒子被用作凝集试剂，选择其直径和密度使得它们对基质的行为基本上与红细胞的一样。此外，公开了在其表面吸附有配体分子的新型合成粒子和这些粒子作为检测试剂的应用。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过凝集作用检测样本液体中分析物的方法，其中将样本液体与凝集试剂和惰性基质接触，反应混合物受引力作用，测定分析物与凝集试剂之间的反应。此外，公开了实施本专利技术的方法的新试剂。通过血凝反应检测分析物的方法和粒子凝集试验是已知的。首先用这些试验检测抗原和抗体以诊断传染病。然而，这些方法的共同缺点是费时、费力，而且结果通常是很难解释。凝胶免疫分析法(其中通过惰性基质中的离心步骤将凝集的血细胞与单独的未凝集红细胞分离(例如参照EP-A-0 194 212，EP-A-0 305 337，EP-A-0 557 546，EP-A-0 634 216，EP-A-0 485 228和WO95/31731))是已知的血凝反应试验，其中未固定的红细胞被用作凝集试剂。在这些方法中，已凝集的红细胞保留于惰性基质上或惰性基质中，于是可明显地与未反应的单个红细胞分离，后者可穿透基质而沉入反应容器底部。只是在EP-A-0 305 337(该申请享受1987年在先申请的优先权)中阐述过合成粒子如胶乳或聚合的琼脂糖也可用作凝集试剂。然而，它未报导这些合成粒子的性能。此外，该文献在后来的专利或其它出版物中未被引用。反之，最近的出版物如EP-A-0 557 546强调用未固定的红细胞作凝集试剂。但是，未固定红细胞的缺点是它们在某些反应条件下的不稳定性，导致溶血作用。该不稳定性通常导致基于未固定红细胞的产物过短终止期。此外，只能以相当费劳力的方式实现标准化和重复性生产红细胞制剂、尤其是抗体偶联或抗原偶联的红细胞制剂。其实这就会使红细胞制剂的物理性质不能保持一致。因此，本专利技术的目的是至少部分地消除用红细胞作凝集试剂引起的前述缺点。确切地说，本专利技术旨在提供可用作凝集试剂的合成粒子，且这种合成粒子能模拟红细胞在已知的凝胶免疫分析中的行为。此外，该合成粒子应允许单纯偶联生物物质，并且应设计成在敏感性和特异性方面至少相当于以前用的红细胞凝集试剂。将这些合成粒子用于凝集试验时，应可能比先前的已知方法更易于操作和评价。通过由凝集作用检测样本液体中分析物的方法来实现上述目的，其中将样本液体与凝集试剂和惰性基质接触，反应混合物受引力作用，测定分析物与凝集试剂之间的反应，其特征在于，选择用作凝集试剂的合成粒子的直径和密度使其对基质的行为基本上与红细胞的一样。意外地发现，如果密度和直径控制得当，则实际上可使生产的合成粒子易于穿透凝胶免疫分析中的惰性基质，于是可完全模拟新鲜的红细胞。在导致本专利技术的实验中，发现与红细胞(直径6-8μm)相比，刚性聚合物粒子的迁移大为延迟。在给定的标准条件下它尤其意味着直径为3-7.5μm的可商购标准粒子在凝胶基质中只是不完全地沉降，而更大(11.9μm)或更小(＜1μm)的合成粒子只稍能透入凝胶。尽管提高参数即延长离心时间(从10min增至50min)和加大离心速度(从1030至1300rpm)可改善沉降，但仍不完全。即使这两项措施可达到最佳沉降，但基于下述原因改变/增大离心时间和速度相当不利1.相对于类似的方法而言，本专利技术的系统尤其应是不费时的方法。所以可能的50min离心时间将会是包括保温的20min预定时间的3倍。2.本领域中的技术人员熟知，提高离心速度会降低凝胶离心法的灵敏度。3.如果可遵循特定的参数，则本专利技术的系统可应用商品化离心机。意外地发现，直径小于红细胞且密度高于通常值的合成粒子通过惰性基质时的行为与红细胞的相当。在这一点上，有可能应用球形和不对称的合成粒子。业已证实平均直径≤5μm且尤其是1～5μm的合成粒子优选适于本专利技术的方法，而平均直径为2～4μm是特别优选的。粒子的相对密度优选≥1.1g/cm3且最好是在1.1～1.8g/cm3范围内。特别地，如果是在标准条件如对于已知的商用红细胞凝胶免疫分析规定的(例如DiaMed)条件下实施检测方法，则相对密度优选在1.1～1.6g/cm3范围内且最优选在1.15～1.4g/cm3范围内。用作本专利技术方法中的凝集试剂的合成粒子优选是有机聚合物或共聚物粒子。特别优选的材料是苯乙烯和苯乙烯衍生物如溴苯乙烯、尤其是其共聚物。制备大小范围一致的、适用作本专利技术的凝集试剂的聚合物粒子，可采用本领域中的技术人员相当熟悉的方法(Arshady(1992)Suspension，emulsion and dispersion polymerizationA methodologicalSurvey.Colloid & Polymer Science 270，717-732；Okubo and Shiozaki(1992)Production of micron-size monodisperse polymer particles byseeded polymerization utilizing dynamic swelling method with coolingprocess.Polymer International 30，469-474)。这些方法通常是将乳液聚合和分散聚合相结合以生产具有严格规定的物理性能的粒子。至于目视检测本专利技术方法中的凝集反应，可于粒子中掺入染料尤其是水不溶性染料。于是，染成蓝色、黄色、绿色、黑色或红色的合成粒子已证实特别适合于目视估测。在本专利技术的一个特别优选的实施方案中，由于其特别好的可检测性而应用红色粒子。合成粒子的强度使之能通过已知的标准工业方法将大量不同的配体固定于其表面。在该技术中最好是固定可与待测分析物结合的配体分子。配体分子可通过吸附性、共价键或高亲和力相互作用来固定。共价偶联例如可通过表面露出的化学活性基团而实现，这类基团的实例有羧基、氨基、醛基和环氧基。借助高亲和作用的固定化可由高亲和力结合对的两个配对物如抗生蛋白链菌素或阿维丁/生物素、半抗原/抗体、糖类/凝集素等介导。这些共价作用和高亲和作用使之能固定配体分子如肽类例如合成制备的肽，蛋白质例如糖蛋白、脂蛋白、重组多肽，免疫球蛋白，核酸例如DNA或RNA、核酸类似物，糖类例如单糖、二糖、寡糖和多糖，脂质，激素，代谢物或其它生物物质。在这方面，可直接完成固定化，或者利用联接基以可控方式实现结合配体分子的优选最适取向。不过，也可以通过纯粹的吸附方法固定配体分子，这对于例如下列物质而言是可能的细胞膜如红细胞、血小板或白细胞的膜，细胞膜碎片，或者细胞或病原体如病毒、细菌或寄生虫的裂解物。如果应用染色的合成粒子，就没必要另外将膜染色。本专利技术的方法涉及检测样本液体中的分析物。体液优选用作样本液体，它可任意稀释，例如血液、血清、血浆、唾液或尿。用于本专利技术方法的样本液体体积可变范围宽，1～200μl的体积优选用于微量试验。所述合成粒子被用作本专利技术方法中的凝集试剂，这些粒子的表面优选含有能与分析物以高亲和力结合的特定配体分子。该凝集试剂通常含数个结合分析物的位点，使之形成包括分析物与凝集试剂的交联凝集复合体。可用本专利技术方法检测的分析物是能与凝集试剂进行专一作用和具有高亲和性的物质例如可由免疫反应测定的抗原和抗体，也可以是可由杂交反应测定的核酸。本专利技术第一个优选的实施方案涉及检测用作样本液体中分析物的抗体，例如抗病原体如病毒(HIV、肝炎病毒)、细菌或原生动物的抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过凝集作用检测样本液体中分析物的方法，其中将样本液体与凝集试剂和惰性基质接触，反应混合物受引力作用，测定分析物与凝集试剂之间的反应， 其中 将合成粒子用作凝集试剂，选择其直径和密度使得它们对基质的行为基本上与红细胞的一样。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P施维德，D巴什福思，RN霍比斯，G马吉茨，MJ马歇尔，MJJ罗伯特，
申请(专利权)人：诊断研究基金会，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]