用于检测动物怀孕的方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术提供了特异性结合早期怀孕因子的，可在动物包括但不限于牛、猫、狗、马、人、羊和猪的体液中发现的抗体。本发明专利技术提供了用于检测动物是否怀孕的方法，在从动物中收集的适宜体液中没有早期怀孕因子则表明没有怀孕。提供了用于检测动物体液中的早期怀孕因子的装置，包括特异性结合早期怀孕因子的抗体。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测动物包括人怀孕和/或植入领域，以及其装置。
技术介绍
医生和兽医一直在寻找可靠的怀孕、植入和可生存怀孕(viable)的检测标记以帮助治疗不孕和早期怀孕治疗。在人类中，以胎盘蛋白标记的为基础的早期怀孕诊断只有在怀孕4周后才可靠，超声分析在受孕7-8周才可靠。在家畜工业中，重要的是能够鉴定交配后受孕不成功的动物。例如，在目前的牛工业中，在交配后的35-40天前没有办法鉴定，而且必须由兽医用扪诊方式鉴定。或者，在21天超声分析可鉴定正在发育的胚胎。兽医扪诊远非最常用的方法，每次检测需花费约4-10美元。超声分析的费用抑制了将超声分析用于常规农场管理。除这些检测的费用外，农场主由于拥有已交配但未受孕的牛，也称为“未确定的”牛(“open”cow)而遭受额外的显著经济损失。“未确定的”牛每天需额外花费农场主4-10美元。较好的奶牛是最难交配的牛，所以当它们是“未确定的”的时，损失甚至更大。第一次交配后，只有不到50％的牛受孕。因此，通常的交配过程允许每头牛2 1/2次受精失败。如果能将牛“未确定的”的时间间隔缩短到数天而不是数月，就可以大大提高总下仔率。已经用一种生物检测方法检测动物中的一种因子，称为早期怀孕因子(EPF)或者最近称为免疫抑制性早期怀孕因子(ISEPF)，据认为，这种因子可抑制母亲对胚胎/胎的免疫反应。尽管通过生物检测说明了活性，但已有文献呈现出ISEPF有数种不同的MW形式。在小鼠中，Clarke等(Clin Exp.Immunol.32318,1978)报道了一种约180000kD的EPF。在羊中，Clarke等(F.Reprod.Immunol.1980 Vol.2151)描述了存在多种形式的EPF，包括20kD，50kD和250-350kD形式。在来自同一实验室的一篇1987年的论文中，Clarke等描述了从怀孕12周的羊胚胎中纯化12kD EPF(J.Reprod.Immunol.1987 10133-156)。Cavanaugh描述了从培养的小鼠卵巢和输卵管中纯化21kD EPF，该EPF由10.5,7.2和3.4kD的三个亚单位组成(J.Reprod.Fertil.71581,1984)。最近已将该因子描述作为高分子量的糖蛋白(Threlfall，1993)，但在本专利技术之前，尚不知功能纯的制品。ISEPF的间接生物检测利用Bach和Antoine(Nature 217658,1968)描述的体外花结抑制试验，该试验测量ISEPF增强抗淋巴细胞血清(ALS)诱导的T细胞与异源红细胞之间花结形成之抑制作用的能力。在花结试验中，必须同时存在两种分子量组分才能检测ISEPF。据推测，在该试验中，ALS从立体上阻碍了红细胞的结合。ISEPF通过使淋巴细胞上的一些结合位点饱和来提高抑制作用(Smart,YC等，Fertil.&Steril.35397,1981)。已在小鼠(Morton等，自然(Nature)2494591974)、大鼠(Heywood,LH等，Australian Soc.for Reprod.Biol.1979)、人(Morton,H等，柳叶刀(Lancet)394 1977)、羊(Morton,H等，Res.in Vet.Sci.26261 1979)、猪(Grewal,AS等，AustralianSoc.for Reprod.Biol.1981)和牛(Nancarrow等J.Reprod.& Fert.57385 1979)中发现了ISEPF。Noonan等(Nature 278629和649 1979)还描述了ISEPF为种非特异性的。如果在交配后不久即出现ISEPF，那么ISEPF可能是优秀的动物怀孕的早期标记。但是，花结试验在技术上很难完成，费时，费力，而且产生大量的假阳性读数(Sinosich等，1985)。为了开发一种可再现且没有大量假阳性信号的ISEPF检测，需要基本上纯的ISEPF制品。在本专利技术之前，尚未报道过高分子量ISEPF的完全纯化方法。仍然需要一种可靠的检测方法以便在受孕后尽可能早地检测怀孕并进一步检测自然流产。还需要能够使动物交配并在12-48小时内确定所述交配是否导致受孕。例如在牛中，可给所述未受孕的牛注射前列腺素并使所述牛再次受孕，使之再次怀孕而不会损失30天。还有能够提高种牛以高比例植入的能力的需要。专利技术概述本专利技术提供本文称为“早期怀孕因子”或ECF的纯化因子，ECF特异性抗体，用于检测取自动物的体液或组织样品中是否存在ECF的试剂盒和装置。描述了在交配12-48小时内用于检测受孕的方法。还提供了受孕和植入后用于检测胎死亡的方法。还提供了利用本专利技术ISEPF和抗ISEPF抗体提高胚胎植入的方法。附图描述附图说明图1是本专利技术支持物的示意图，表明1)一种支持物，在其上已分析了含ECF的样品(ECF阳性)和2)一种支持物，在其上已分析了不含ECF的样品(ECF阴性)；“T”标明待测或抗ECF抗体带的位置；“C”标明对照抗体的带。图2与本专利技术支持物在接触中的物体的示意图，以开放和封闭位置标明。专利技术详述定义在本文中，可将“受孕”与“受精”交换使用。在本文中，“一种”可以是一个或一个以上。在本文中，“纯化的”指充分不含与其正常共存的污染或细胞组分从而将其与其天然环境中的污染或其他组分区别开的蛋白质(多肽、肽等)。纯化的蛋白质可以是同质的，但无需是均质的。它必须充分不含污染物以便用于临床或研究，例如用于检测蛋白质的抗体的检测。详细描述本专利技术提供了与纯化的ECF特异性结合的抗体。所述抗体可与抗原的特有表位特异性反应或者它们也可与其他生物的表位反应。术语“结合”指能够与抗原反应或者与抗原非随机相连。“特异性结合”、“特异性反应”或者“特异性针对”描述了基本上不与任何抗原交叉反应，而只与一种具体的，在这种情况下，仅与纯化的ECF反应。优选，按照通过在4-15％梯度聚丙烯酰胺凝胶中的变性凝胶电泳中测量的，纯化ECF的分子量为190000-205000，适宜的MW标准包括20000、144000和208000。通过除去所有非糖蛋白的最初纯化步骤得到糖蛋白ECF。该步骤可以是高氯酸提取。按本文所述将所得的糖蛋白馏份用于生产抗体并治疗动物，包括人。按实施例1所述，可将ECF通过离子交换色谱进一步纯化，再用柱色谱纯化，得到馏份A1、A2和B。将这些馏份合并得到进一步纯化的ECF。用实施例1所述的一个或多个步骤纯化的ECF以及其馏份A1、A2和B可以得自牛、猫、狗、人、马、羊和猪。本专利技术提供了可识别并结合来自牛、猫、狗、人、马、羊和猪的ECF的抗体。本专利技术抗体可以是来自任何动物的任何同种型，例如IgG、IgM或IgA，它们可以是多克隆的、单克隆的，人源化的，全人的或嵌合的。所述抗体可以是单价或二价单链抗体。如本文所预期的，抗体包括结合ECF的任何配体，例如完整抗体、抗体片段或者与抗原有反应性的其他试剂。从一个种的ECF产生的抗体可用于识别并结合来自其他种的ECF。按照本领域已知的方法完成种间抗原一抗体反应的优化，包括抗体-抗原与用于提高特异性的封闭蛋白间比例的优化。优选，从一给定种的ECF产生的抗体可用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性结合纯化的早期怀孕因子的分离的抗体。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：NT乔丹，JD乔丹，
申请(专利权)人：康瑟普托诊断公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]