结肠癌和胰腺癌的重组单克隆抗体和相应抗原制造技术

本发明专利技术提供了与人结直肠癌和胰腺癌相关抗原结合的重组单克隆抗体，以及编码所述抗体链的核酸序列、对应于所述核酸的氨基酸序列，以及这些抗体、核酸和氨基酸的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及重组单克隆抗体和肽的领域，及其在临床和科学方法(包括诊断 方法)中的用途，尤其当这种方法涉及人结直肠癌和胰腺癌相关抗原(colorectal and pancreatic carcinoma-associated antigen, CPAA)的检测以及涉及被所述重组单克隆抗 体和肽识别之表位的表征时。本专利技术还提供了用于本专利技术诊断和/或治疗方法的采用诊断 化合物和/或药物组合物形式的抗CPAA抗体和肽，用于诊断和/或治疗结直肠癌和胰腺癌 相关病症。
技术介绍
根据世界卫生组织的最新数据，全世界范围内总共五千八百万的死亡人数中，癌 症占所有死亡人数的13%。预计世界上死于癌症的人数将会上升，估计在2015年会有 九百万人死于癌症，在2030年将会超过一千一百万人死于癌症。在所有癌症中，结直肠癌 在美国是癌症相关死亡的第三大死因，而胰腺癌在男性和女性中是在最常见癌症中排名第 11位并且是第四大癌症死因。这种严峻的形势表明亟需新的癌症诊断和治疗。现代技术(如涉及使用杂交瘤的技术)使研究人员和临床医生可得到可用于 一般性诊断和临床方法的高特异性且强效的单克隆抗体来源。例如，目前FDA批准的 用于结直肠癌的治疗性抗体，如AVASTIN (贝伐单抗(bevacizumab)，Genentech， Inc. )、ERBITUX (西妥昔单抗(cetuximab)注射品，ImClone Sys. Inc. /Merck/ Bristol-Myers Squibb)和 VECTIBIX (帕木单抗(panitumumab)，Amgen Inc.)。然而，抗击癌症的最重要挑战仍然是寻求早期诊断。诊断时癌症分期越晚，有效 治疗的可能性就越小。美国癌症协会估计，诊断患有1期结肠癌的美国人在诊断后5年有 90%仍然存活，但诊断患有3期癌症的患者在诊断后5年只有68%仍然存活。因此，尽管癌症研究取得进展，但仍需要可用于结肠癌和胰腺癌早期诊断和治疗 的重组单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供特异性针对人结直肠癌和胰腺癌相关抗原(CPAA)之抗 原和表位的重组单克隆抗体或重组单克隆抗体之部分(肽)。因此，本专利技术的一个目的是提 供特异性针对CPAA蛋白质和肽(例如这些蛋白质或肽上的表位)的重组单克隆抗体或其 部分(例如互补位(paratope))。本专利技术另一目的是提供寡核苷酸(例如cDNA)，其核苷酸序列(基因)编码上述重 组抗体之重链和轻链的部分或全部。因此，本专利技术的一方面提供了编码单克隆抗体可变区(特别是识别CPAA、尤其是识别通常存在于特定CPAA中抗原决定簇或表位的可变区)的基 因。本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本专利技术的另一目的是提供使 用上述重组载体获得的转化体。本专利技术的又一目的是提供特异性针对CPAA的重组抗体，其中所述抗体用标志物 标记，使其易于分离并在使用所述抗体用于研究、诊断和临床目的中提供多种用途。本专利技术 的另一方面提供了嵌合抗体，其包含分别与人免疫球蛋白Y-1和K恒定区连接的CPAA特 异性鼠抗体的重链和轻链可变区。本专利技术的另一目的是提供特异性针对CPAA的完全人源 化重组抗体。在该实施方案的一个方面中，优化所述完全人源化的重组抗体，以降低其在人 中的免疫原性，同时维持其功能性。本专利技术的另一目的是提供使用本文公开的重组抗体用于研究、诊断和临床用途的 方法。特别地，本专利技术的一个目的是提供(可能在无疾病症状的患者中)用于癌症早期检 测的诊断工具。另一方面提供了用于区分迟缓型和侵袭型胰腺癌的免疫组化工具。本专利技术的另一目的是提供用于促进肿瘤退化或触发转化细胞死亡的方法，其包括 向有此需求的患者施用结合CPAA抗原的抗体、其部分、片段、肽或衍生物，其中所述抗体以 足以促进肿瘤退化或细胞死亡的量来施用。本专利技术的另一目的是提供使用抗CPAA抗体和/或抗CPAA肽用于体外、原位和/ 或体内诊断和/或治疗与存在CPAA相关的动物细胞、组织或病症的方法。本专利技术还提供了 采用药物和/或诊断化合物和/或组合物形式的抗CPAA抗体和肽，其用于本专利技术中诊断和 /或治疗CPAA相关病症的诊断和/或治疗方法。本专利技术还涉及含有两条轻链和两条重链的抗CPAA嵌合或人源化抗体，其中各链 含有至少部分的人恒定区以及至少部分的特异性针对CPAA的非人源可变区(V)，所述抗体 以高亲和性和/或高亲合力结合CPAA相关细胞的抑制性和/或中和性表位。本专利技术还包 括此类抗体的片段或衍生物，例如抗体链的一个或多个部分，如重链恒定区、连接区、多样 性区或可变区，或者轻链恒定区、连接区或可变区。抗体部分的实例有抗体的一个或多个互 补决定区(CDR)，其确定了与CPAA的特异性结合。本专利技术的另一目的是表征被所述单克隆抗体或其部分识别的CPAA肽。这样的抗 原性肽可用于产生其它抗原结合配体或者用作疫苗或其它免疫刺激手段。还提供了制备和使用抗CPAA抗体和肽用于本专利技术多种用途的方法，例如但不限 于杂交瘤、重组或化学合成方法来生产本专利技术的抗CPAA抗体或抗CPAA肽；检测溶液或细胞 中的CPAA ；体外、原位或体内抑制带有CPAA之细胞的一种或多种生物活性，包括杀死这种 带有CPAA的细胞。因此，这样的抑制和杀死可包括本专利技术用于减轻涉及带有CPAA之细胞 的症状或病症(如恶性肿瘤)的治疗方法。附图说明图1显示Hollinshead “疫苗”(一种结直肠癌和胰腺癌细胞膜的纯化制备物)的 HPLC洗脱谱图。图2表示16C3鼠抗体K轻链的DNA序列。推定的ATG起始密码子用粗体/下划 线表示，推定的TAG终止密码子用斜体/下划线表示。图3表示16C3抗体IgG重链的DNA序列。推定的ATG起始密码子用粗体/下划 线表示，推定的TGA终止密码子用斜体/下划线表示。图4表示16C3抗体k轻链的氨基酸序列。⑶R区域用粗体/下划线字体表示。图5表示16C3重链的氨基酸序列。⑶R区域用粗体/下划线字体表示。图6表示几种人源化16C3可变轻链。16C3是鼠抗体序列，“Venl6C3”已用人框架 序列进行“镶嵌”，cdrl6C3已用人⑶R氨基酸重新改造，abbl6C3表示缩短的⑶R嫁接 (grafting)，“sdrl6C3”表示位点决定氨基酸改变，“fral6C3”表示通过使用多种人可变区 “片段”的组合利用“Frankenstein”方法重新改造可变区。数字代表Kabat编号。图7表示几种人源化163可变重链。缩写和图6中的一致。图8是使用针对未经处理之16C3肿瘤抗原的16C3抗体对多种细胞系进行 western印迹分析的放射自显影图。TU =患者切除的肿瘤样品(结直肠)；LS = LS174 ;CF =CFPAC-1 ；AS = ASPC-1 ； HT = HT29。图9是代表经蛋白酶V8处理的16C3肿瘤抗原的western印迹的放射自显影图。 用蛋白酶V8处理来自LS174细胞系的16C3抗原，以及利用western印迹进行抗原检测。LS =未处理的抗原；V81 =用蛋白酶V8在室温(RT)下孵育1小时；V83 =用蛋白酶V8在室温 下孵育3小时；V824 =用蛋白酶V8在室温下孵育24小时。图10显示代表经PNG酶-F(PNG本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的重组单克隆抗体，其包含：两个轻链组分和两个重链组分，其中每个所述轻链组分含有图４中所示的氨基酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）或者该序列的突变体、变体、同源物、部分、片段或衍生物，每个所述重链组分含有图５中所示的氨基酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）或者该序列的突变体、变体、同源物、部分、片段或衍生物，其中所述抗体表现出特异性针对结直肠癌和胰腺癌细胞的ＡＤＣＣ活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-11-8 60/996,255分离的重组单克隆抗体，其包含两个轻链组分和两个重链组分，其中每个所述轻链组分含有图4中所示的氨基酸(SEQ ID NO14)或者该序列的突变体、变体、同源物、部分、片段或衍生物，每个所述重链组分含有图5中所示的氨基酸(SEQ ID NO15)或者该序列的突变体、变体、同源物、部分、片段或衍生物，其中所述抗体表现出特异性针对结直肠癌和胰腺癌细胞的ADCC活性。2.包含权利要求1之抗体的诊断试剂盒。3.包含权利要求1之抗体和载体的组合物。4.权利要求1的抗体，其中所述抗体与标记物连接。5.嵌合抗体，其包含分别与人免疫球蛋白Y-I和κ恒定区连接的权利要求1所述重 组抗体轻链和重链的可变区。6.包含权利要求5之抗体的诊断试剂盒。7.包含权利要求5之抗体和载体的组合物。8.权利要求5的抗体，其中所述抗体与标记物连接。9.抗体或抗体的部分，其包含由氨基酸残基GASENIYGALN(SEQ ID NO :1)或QASENIYGALN(SEQ ID NO :4)组成的轻链 互补决定区(⑶R) 1 ；由氨基酸残基 GASNLAD (SEQ ID NO 2)或 GASNLAT(SEQ IDNO 5)组成的轻链 CDR2 ；由氨基酸残基 QNVLSSPYT(SEQ ID NO :3)或 QQVLSSPYT(SEQ ID NO :6)组成的轻链 CDR3 ；由氨基酸残基GYTFTDYAMH(SEQ ID NO 7)组成的重链CDRl ；由氨基酸残基 LISTYSGDTKYNQNFKG(SEQ ID NO 8)或 ISTYSGDTKYNQNFQG (SEQ ID NO: ...

【专利技术属性】
技术研发人员：J安德鲁布里斯托尔，朱迪斯A坎托尔，
申请(专利权)人：尼尔詹尼克斯肿瘤研究公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]