一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法技术

本发明专利技术公开了一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其步骤是：Ａ．细胞培养并固定于盖玻片上，制备细胞爬片：ａ：在接种细胞前，先将灭菌后的爬片放入培养皿，再加入培养基和细胞；ｂ：将含有待检测细胞的悬液滴加在爬片上，使其风干；收集细胞爬片；漂洗；细胞固定；漂洗；细胞穿透；漂洗：吸除穿透剂；Ｂ．免疫荧光染色：预备封口膜和ＰＢＳ；封闭；一抗孵育；二抗孵育；装载爬片；Ｃ．荧光显微镜下观察荧光及拍照。简便易行。操作简便，容易掌握，所有操作在室温下进行。达到省时间、省贵重试剂，质量／效果好。能准确地定位抗原的位置和显示相对量，所标记靶分子的荧光清晰而背景荧光很低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞分子生物学
，具体涉及一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，该方法用于细胞生物学、分子生物学、免疫学、微生物学、病理学及临床检验中对完整细胞(包括微生物)目标抗原的可视化检测。
技术介绍
免疫荧光分析法(Immunofluorescence assay，IFA)是细胞、分子生物学常用的一种实验方法。按照样品特性，免疫荧光分析法分为2大类：一类用于标记固定在玻片(盖玻片或载玻片)上的细胞(BhattacharyyaD，Hammond AT and Glick BS.High-quality immunofluorescence of cultured cells[J].Methods Mol Biol，2010，619：403-410.)；另一类即指流式细胞仪荧光分析细胞悬液(Cunningham RE.Indirect immunofluorescent labeling offixed cells[J].Methods Mol Biol，2010，588：335-339.)。前者的主要目的是展示细胞结构(例如肌动蛋白丝)、胞内目标蛋白质的定位、细胞表面分子分布等(Bhattacharyya D，Hammond AT and Glick BS.High-quality immunofluorescence of cultured cells[J].Methods Mol Biol，2010，619：403-410.；Lee AW，Hertel L，Louie RK，et al.Human cytomegalovirus alters localization of MHC class II and dendrite morphology in mature Langerhans cells[J].J Immunol，2006，177(6)：3960-3971.)。后者的主要目的是分选细胞、统计细胞中标志性蛋白的阳性率。用于检测玻片样品的免疫荧光分析有2种制备样品的方法：(1)使细胞在特制的盖玻片(即细胞爬片)上生长，使细胞自然贴附于玻片上；(2)将待检测的细胞(包括动/植物细胞和微生物)(Taber LH，Brasier F，Couch RB，et al.Diagnosis of herpes simplex virus infection by immunofluorescence[J].J ClinMicrobiol，1976，3(3)：309-312.；Didier ES，Orenstein JM，Aldras A，et al.Comparison of three staining methods for detecting microsporidia in fluids[J].J Clin Microbiol，1995，33(12)：3138-3145.)悬液滴到玻片上，使其风干并贴附于玻片上。我们公开的是一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，属于分析细胞爬片样品(第一类)的免疫荧光分析方法。按照抗体的使用，免疫荧光分析分为间接免疫荧光分析和直接免疫荧光分析2种。间接免疫荧光分析方法通过抗原特异性第一抗体(一抗)标记抗原，再用荧光分子耦联的第二抗体(二抗)特异性标记一抗，从而使抗原所在位点发出荧光。而直接免疫荧光分析是用荧光分子耦联的抗原特异性的抗体直接标记抗原的方法。无论是间接免疫荧光分析还是直接免疫荧光分析，我们公开的一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法均适用。与同类型的几种免疫荧光分析方法(Bhattacharyya D，Hammond AT and Glick BS.High-quality immunofluorescence of cultured cells[J].Methods Mol Biol，2010，619：403-410.；Taber LH，Brasier F，Couch RB，et al.Diagnosis of herpes simplex virus infection by immunofluorescence[J].J Clin Microbiol，1976，3(3)：309-312.；-->Cunningham RE.Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells[J].Methods Mol Biol，2010，588：335-339.；Rosner K，Mischke R and Schuberth HJ.Evaluation of a standard immunofluorescence assay and a new flow cytometric method for the detection of autoreactive antibodies in dogs with tumours[J].Res Vet Sci，2007，82(1)：27-33.；Inoue N，Mar EC，Dollard SC，et al.New immunofluorescence assays for detection of Human herpesvirus 8-specific antibodies[J].Clin Diagn Lab Immunol，2000，7(3)：427-435.；Thomp son TA and Wilkinson HW.Evaluation of a solid-phase immunofluorescence assay for detection of antibodies to Legionella pneumophila[J].J Clin Microbiol，1982，16(1)：202-204.)相比，我们公开的一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法至少节省40-70分钟(min)。我们公开的这种新方法包括15min封闭孵育和10min的抗体(一抗或二抗)孵育，而其它方法需要20-60min进行封闭孵育(Bhattacharyya D，Hammond AT and Glick BS.High-quality immunofluorescence of cultured cells[J].Methods Mol Biol，2010，619：403-410.；Strang BL，Boulant S and Coen DM.Nucleolin associates with the human cytomegalovirus DNA polymerase accessory subunit UL44and is necessary for efficient viral replication[J].J Virol，2010，84(4)：1771-1784.；Thornton CR and Talbot NJ.Immunofluorescence microscopy and immunogold EM for investigating fungal infection of plants[J].Nat Prot本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其步骤是：Ａ、细胞培养并固定于盖玻片上，制备细胞爬片：１）细胞爬片的制备过程是：ａ：在接种细胞前，先将灭菌后的爬片放入培养皿，再加入培养基和细胞，使细胞均匀地贴附在爬片上表面和未被爬片覆盖的培养皿底部，待细胞贴壁后按各自的实验计划培养和处理细胞，在细胞贴附及生长过程中不要爬片相互重叠，所用细胞为成纤维细胞，培养基为ＭＥＭ；ｂ：将含有待检测细胞的悬液滴加在爬片上，使其风干：２）收集细胞爬片：用镊子将细胞培养皿中的爬片取出，放入１２孔板中，爬片正面向上；３）漂洗：吸除１２孔板中的ＰＢＳ，再次加入ＰＢＳ并吸除；４）细胞固定：向每个孔加入１ｍｌ固定剂３％Ｍ／Ｖ甲醛溶液，室温放置１０ｍｉｎ；５）漂洗：吸除固定剂，用ＰＢＳ洗２次；６）细胞穿透：每孔加入１ｍｌ穿透剂，１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００，室温放置５－１０ｍｉｎ；７）漂洗：吸除穿透剂，用ＰＢＳ洗；Ｂ．免疫荧光染色：１）预备封口膜和ＰＢＳ；２）封闭：配制并点加封闭液，将３０μｌ胎牛血清与７０μｌ的无血清封闭液混合，爬片的漂洗与沥干，夹住爬片，使爬片浸／出ＰＢＳ进行漂洗，然后把爬片的一边放纸巾上吸去多余ＰＢＳ，爬片盖于封闭液上，室温孵育１５ｍｉｎ；终止封闭，用１０００μｌ的移液枪向爬片的边缘注入ＰＢＳ，爬片浮起，漂洗与沥干；３）一抗孵育：配制一抗溶液，爬片盖于一抗溶液上，室温孵育１０ｍｉｎ；终止一抗孵育，用１０００μｌ的移液枪向爬片的边缘注入ＰＢＳ，爬片浮起，漂洗与沥干；４）二抗孵育：配制二抗溶液，爬片盖于二抗溶液上，室温孵育１０ｍｉｎ；终止二抗孵育，用１０００μｌ的移液枪向爬片的边缘注入ＰＢＳ，爬片浮起，漂洗与沥干；５）装载爬片：准备爬片，点加抗荧光衰退剂，清洁爬片，将爬片盖于载玻片上的抗荧光衰退剂上，用镊子轻压爬片贴紧载玻片；用吸除爬片周围多余的抗荧光衰退剂，在爬片边缘点上指甲油固定，观察或保存样品；Ｃ．荧光显微镜下观察荧光及拍照。...

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法，其步骤是：A、细胞培养并固定于盖玻片上，制备细胞爬片：1)细胞爬片的制备过程是：a：在接种细胞前，先将灭菌后的爬片放入培养皿，再加入培养基和细胞，使细胞均匀地贴附在爬片上表面和未被爬片覆盖的培养皿底部，待细胞贴壁后按各自的实验计划培养和处理细胞，在细胞贴附及生长过程中不要爬片相互重叠，所用细胞为成纤维细胞，培养基为MEM；b：将含有待检测细胞的悬液滴加在爬片上，使其风干：2)收集细胞爬片：用镊子将细胞培养皿中的爬片取出，放入12孔板中，爬片正面向上；3)漂洗：吸除12孔板中的PBS，再次加入PBS并吸除；4)细胞固定：向每个孔加入1ml固定剂3％M/V甲醛溶液，室温放置10min；5)漂洗：吸除固定剂，用PBS洗2次；6)细胞穿透：每孔加入1ml穿透剂，1％Triton-X-100，室温放置5-10min；7)漂洗：吸除穿透剂，用PBS洗；B.免疫荧光染色：1)预备封口膜和PBS；2)封闭：配制并点加封闭液，将30μl胎牛血清与70μl的无血清封闭液混合，爬片的漂洗与沥干，夹住爬片，使爬片浸/出PBS进行漂洗，然后把爬片的一边放纸巾上吸去多余PBS，爬片盖于封闭液上，室温孵育15min；终止封闭，用1000μl的移液枪向爬片的边缘注入PBS，爬片浮起，漂洗与沥干；3)一抗孵育：配制一抗溶液，爬片盖于一...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗敏华，段莹亮，伊丽莎白福尔图那托，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]