一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法及其用途。本发明专利技术还涉及一种从人外周血样本中鉴定上皮组织来源肿瘤细胞的方法，其中采用兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法。本发明专利技术所述鉴定方法可从少量人体外周血样本分离出的有核细胞中简单、快捷、准确地鉴定出存在于血液循环中的上皮组织来源的肿瘤细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法及其用 途。本专利技术还涉及一种从人外周血样本中鉴定上皮组织来源肿瘤细胞 的方法，其中采用兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法。本专利技术所 述鉴定方法可从少量人体外周血样本分离出的有核细胞中简单、快捷、 准确地鉴定出存在于血液循环中的上皮组织来源的肿瘤细胞。
技术介绍
目前常用的细胞化学染色技术的主要方法包括瑞氏染色、姬姆 萨染色、瑞氏-姬姆萨复合染色、巴氏染色和苏木素伊红染色，相关染 色才支术概述如下瑞氏染色瑞氏染料中含有美蓝和伊红两种染料，前者为碱性， 后者为酸性，细胞核染色质与强碱性的组蛋白、精蛋白等，形成核蛋 白，这种强碱物质与瑞氏酸性染料伊红有亲和力，故染成红色；但核 蛋白中还有少量的弱酸性蛋白和氨基酸，它又与瑞氏染料中的美蓝起 作用，只因其量太少，而不显蓝色，故细胞核呈紫红色。姬姆萨染色染料主要为伊红、美蓝两种成分，染色原理与瑞氏 染色相同。瑞氏-姬姆萨复合染色由于上述两种染色原理基本相同，混合染 色法的优点是，瑞氏染液对胞浆着色好，姬姆萨染液则对核着色好， 两法合并，可以兼得两者的优点。因此在细胞学的检查中，常用两者 进行复合染色。巴氏染色巴氏阴道及痰液等脱落细胞学检查的一种主要染色方 法。苏木素对细胞核着色，其他染料可与细胞浆中不同的化学成分结 合而使其着色。涂片经巴氏染色后，细胞核结构清晰，分色明显，透明度好，胞浆着色艳丽。缺点是试剂种类很多，染色手续繁杂，时间 长，不宜涂厚片等。苏木素伊红染色原理与巴氏染色法基本相同。适合黏液及细胞 较多，较厚的涂片和切片观察组织层次。以上几种细胞化学的染色方法大都强调对细胞核的染色， 一旦对 细胞进行染色，将无法进行后续的细胞免疫荧光和染色体倍体分析。为克服现有细胞染色技术的上述缺陷，本专利技术人采用了一种能够 适于进一步进行免疫荧光分析的细胞化学染色方法，即兼容免疫荧光 分析的细胞化学染色方法。所述兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方 法，是一种改进的苏木素细胞染色方法在采用苏木素对细胞核的染色 同时，不影响后续的细胞表面标志物的免疫荧光分析和染色体倍体的 DNA原位杂交分析，适用于多种细胞类型的染色，包括胚胎时期内胚 层、中胚层和外胚层分化的所有类型的正常细胞，尤其适用于针对人检测。尸检发现人类血液中存在上皮组织来源肿瘤细胞的现象已近百 年，根据其特性又称之为血液稀有细胞、胂瘤微小转移病灶、循环紳 瘤细胞和循环上皮细胞等。通常，血液中可能出现的上皮组织来源的肿瘤细胞涉及覆盖于身 体表面和衬贴在有腔器官腔面的被覆上皮(如，皮肤、消化管、呼吸 系统及泌尿系统)和具有分泌功能的腺上皮(如，肝脏、胰腺、甲状 腺、肾上腺)来源的实体肿瘤。动态监测血液中上皮组织来源肿瘤细胞的数量和变化，间接了解 肿瘤治疗疗效与进展，具有重要的科学意义和广泛的临床应用前景。 对血液中上皮组织来源肿瘤细胞鉴定和数量统计，能够间接了解肿瘤 尤其是实体肿瘤的进展与治疗疗效。例如，监测乳腺癌患者外周血样本中上皮组织来源肿瘤细胞数目可以间接判断患者预后。通常认为， 转移乳腺癌患者7. 5ml外周血具有> 5个肿瘤细胞者较7. 5ml外周血 <5个肿瘤细胞者的无进展生存期和总体生存期大为缩短。研究表明，进入血液的上皮组织来源肿瘤细胞主要有三种存在形式①以完整细胞形式存在并处于静止增殖状态；②在各种剪切力 作用下细胞膜破裂以棵核形式存在，继而逐步凋亡；③以完整细胞形式存在，在特定条件下进入活跃增殖状态并锚定于靶器官的毛细血管。 检测外周血样本上皮组织来源肿瘤细胞的技术一般要求具有微创、实时、快捷、受试者易于接受等特点，主要涉及获得与富集血液 中非血细胞来源的有核细胞，并从中鉴定上皮组织来源肿瘤细胞等两 个步骤。具体的，目前有多种方法可以有效的分离和富集血液中非血 细胞来源的有核细胞，其中以免疫磁珠富集技术应用最为广泛；而鉴 定上皮組织来源肿瘤细胞，目前主要采用抗上皮细胞表面抗原联合抗 肿瘤相关抗原的免疫荧光染色法，例如分别用红、绿荧光素标记抗上 皮细胞抗原(EpCAM和cytokeratins 8， 18，和/或19)、抗白细胞 表面抗原(CD45)和抗肿瘤相关抗原(CA19-9、 CEA、 HER2/neu、粘蛋 白、P-hCG、甲胎蛋白、PSA和PSMA等)染色，继而用DAPI染料对 细胞核DM复染等联合判定对样品染色40秒至1分钟。在本专利技术的一个具体实施方案中，所述方法包括如下步骤1、 将经富集的有核细胞样本用40微升lxPBS溶液(137mMNaCl， 2.7 mM KC1， 10mM Na2HP04, 2 mM KH2P04， pH 7.4)重悬后均匀滴加 在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；2、 95%乙醇固定15分钟；3、 蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；4、 选择浓度为1. 3mg/ml — 1.6mg/ml的苏木素染液对样品染色40秒至l分钟；5、 自来水浸泡约10分钟，洗去多余染液后再用蒸馏水洗涤一遍；6、 95%乙醇脱水5秒钟后再以0. 5%伊红染液(北京中杉金桥生 物技术有限公司，货号ZLI-9046 )染色4分钟；7、 70%乙醇洗涤2次，95%乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95% 乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟，用中性树胶封片。根据兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法的特点，本领域普通 技术人员容易知晓，所述染色方法适于对如下类型的细胞进行染色， 而不影响对所述细胞类型进一步进行免疫荧光分析，合适的细胞类型 包括胚胎时期内胚层、中胚层和外胚层分化的所有类型的正常细胞和 肺瘤细胞，尤其适合针对来自于如下类型上皮来源肿瘤的细胞的染色， 包括但不限于唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、曱状腺癌、食管癌、 胃癌、肠癌、肝癌、胆嚢癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴 癌、阴道癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前 列腺癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌， 以及实验室常规采用的体外培养细胞系C0S-"7细胞、CH0细胞、 NIH3T3细胞、BHK-21细胞、HeLa细胞等。本专利技术的另一方面涉及一种针对人体外周血样本分离出的血液中 非血细胞来源的有核细胞，简单、快捷、准确地鉴定其中包括棵核细月包在内的全部上皮组织来源肺瘤细胞的有效鉴别方法，其中，采用了 本专利技术所述的兼容免疫荧光染色方法。在本专利技术中，所迷鉴别方法适于检测通过常规阳性和阴性富集技 术，例如免疫磁珠富集技术分离和富集的血液中非血细胞来源的有核细胞。所述方法包括如下步骤1 )细胞滴片制备及染色针对采用例如免疫磁珠富集技术分离和 富集获得的血液有核细胞，其中含部分白细胞和可疑上皮组织来源肿 瘤细胞，经细胞滴片、固定后行本专利技术所述兼容免疫荧光分析的细胞 化学染色；2) 细胞形态学分析经普通光学显微镜镜检，判定属于典型上皮 组织来源肿瘤细胞的个数(nl);对无法判定的可疑细胞，记录细胞 所在位置；3) 细胞表面标志分析例如通过选自如下的细胞表面标志抗上 皮细胞标志(EpCAM和cytokeratins 8， 18，和/或19)、肺瘤相关 抗原(CA19-9、 CE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法，其特征在于与常规苏木素染色相比，所采用的苏木素染液中苏木素的浓度是现有苏木素－伊红染色方法中苏木素浓度的４０％－５０％，同时，染色时间是现有苏木素伊红染色方法时间的５０％－６７％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓航，何平，任传利，郑朝旭，赵平，王成峰，周兰萍，许杨，乔媛媛，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤研究所，中国人民解放军海军总医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]