本发明专利技术涉及一种通过使用合成校正粒子的免疫荧光法自动测定免疫荧光灶点的方法，以及实施该方法的系统和试剂盒。在一个优选实施方案中，该方法特征在于免疫荧光灶点是γH2Ax灶点。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及一种通过使用合成校正粒子的免疫荧光法自动测定免疫荧光灶点的方法，以及实施该方法的系统和试剂盒。在一个优选实施方案中，该方法特征在于免疫荧光灶点是γH2Ax灶点。【专利说明】使用基于细胞的免疫荧光法使用合成校正粒子自动测定免疫荧光灶点的方法和系统描述本专利技术涉及用免疫荧光法自动测定细胞免疫荧光灶点的方法，所述方法包括提供待分析的细胞和合成校正粒子的混合物，借以细胞和粒子固定至固相，检测合成校正粒子，随后基于对合成校正粒子的检测校正并对焦荧光显微装置和自动评价系统，将所述混合物与一种或多种结合于细胞的靶底物的抗体温育，通过所述荧光显微装置检测与所述底物结合的抗体，并且使用所述自动评价系统由所述荧光显微装置产生的图像数据测定免疫荧光灶点。在一个优选实施方案中，该方法特征在于免疫荧光灶点是Y H2Ax灶点。
技术介绍
使用不同免疫荧光设备和方法的不同实验室之间的免疫荧光分析的标准化和自动化代表生物测定和诊断领域中的一项重大挑战。高度敏感及选择性地检测和评价荧光信号，特别在基于细胞的测定中，已经导致作为用于生物分析和诊断中的最重要检测方法的一些方法的荧光测定法的研发。荧光检测，例如使用荧光显微术的优点涉及检测的高灵敏度、使用细胞中的靶物体的荧光标记的相对简单的方法以及凭借使用具有不同标记的不同靶物体的多重标记进行多个参数的平行分析的可能性。因此这种方法替代更复杂的方法如吸收测量法和复杂且有问题的放射测量法。然而，间接免疫荧光试验(IIF)的手工测定和评价受各种主观因素影响并且额外地受专用装置技术参数影响。除常使用的细胞底物和试剂之外，显微镜技术还包括荧光滤光片、物镜、光源和待研究的荧光图像的分析，因而这些因素的每一种均需要标准化，以便提供可靠和可比较的结果，尤其当考虑在采用不同显微设备和方法的不同实验室之间比较时。对于健康产业而言显示强大分析前景，但是在不同实验室之间缺少足够标准化和/或自动化的免疫荧光法的一个例子是通过检测DNA双链断裂(DSB)分析DNA损伤，其中Y H2Ax是检测DNA双链断裂的已知标记。DNA代表包含单核苷酸的聚合物，所述单核苷酸自身包含碱基、脱氧核糖和磷酸基。核DNA是遗传信息的通用载体。在细胞核中，DNA与组蛋白形成复杂的结构，所述结构以核小体的形式存在，这使得控制多种核过程成为可能，原因在于染色质的结构布置。例如，在细胞分裂期间，在染色质中出现特定形态学变化，所述形态学变化允许形成固缩的染色体，所述固缩的染色体随后对于染色体可靠地分离进入子代细胞是必需的。DNA复制和转录受复杂的酶系统调节，所述酶系统也必须与染色质相互作用，以便执行它们的功能，这代表维持细胞代谢的基础。重要的是DNA分子本身和其内部所编码的信息在各种细胞过程和核过程(例如，仅列举几例，转录、复制和细胞分裂)期间自始至终保持稳定。细胞的DNA总是受各种代谢过程的直接或间接影响，所述代谢过程可以潜在地修饰DNA的分子结构。DNA结构的某些变化对维持或执行DNA功能是必需的，例如在产生抗体的细胞发育期间或当单个碱基甲基化时在复制后立即出现短暂的链断裂。然而，并不将压倒性数量的此类变化(例如DSB)视作重要的或预期的事件，反而将其视为对完整生物潜在危险的突变的原因。除内源过程，例如因代谢产物诸如自由基之外，DNA损伤可以因外源过程，例如因电离、紫外辐射或致突变化学品而发生。电离辐射可能导致许多人类的损害作用，而DNA DSB是最重要之一(1-3)。活组织的电离辐射作用是基于能量转移到细胞上，因而细胞损伤的程度取决于多种因素。最重要的是放射核素的辐射物理特性、吸收剂量、暴露持续期、生物系统的辐射敏感性、局部能量沉积以及辐射的能量密度(线性能量转移，LET) (4-7)。细胞的存活取决于其DNA的完整性，因而恶性细胞的根除可以因DNA的大量损伤而发生。作为物理过程的结果，DNA发生许多化学变化，这导致DNA损伤并因此导致突变和细胞可能死亡(8，9)。在这个意义上，生物上最相关的损伤涉及DNA的DSB和单链断口(SSB)。在真核细胞中，DNA是高度浓缩的并定位于染色质结构内，因而染色质的基础元件是核小体，其包含围绕蛋白质核芯(组蛋白八聚物)缠绕1.7圈的146个DNA碱基对。核小体的蛋白质核芯由八聚物组成，所述八聚物包含以下每种组蛋白的两个:组蛋白H2A、H2B、H3和H4。每种核小体进一步与Hl组蛋白结合,所述Hl组蛋白结合连接相邻的核小体的DNA0组蛋白的修饰，如乙酰化、脱乙酰化或磷酸化，调节局部染色质结构并且因此在调控各种核功能，如复制、转录或DNA修复方面发挥作用。在DSB后组蛋白修饰的一个例子是组蛋白H2Ax的丝氨酸139的磷酸化。丝氨酸139已经磷酸化的H2Ax常称作Y H2Ax。H2Ax占染色质中的H2A群体大致10%并且似乎均匀分布。如果DSB出现，则在数分钟内H2Ax蛋白被磷酸化以形成yH2Ax。这种磷酸化借助蛋白激酶(毛细血管扩张性共济失调突变蛋白(ATM)、DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)、毛细血管扩张性共济失调及RAD3相关蛋白(ATR)发生(10-12)。磷酸化在DSB的最近接的区域内启动并且从那里扩展开来，从而最终H2Ax分子由DSB本身多达数百万碱基被磷酸化。可以作为灶点被检测到的核复合体涉及由Y H2Ax、修复蛋白和作为细胞周期的检查点控制蛋白发挥作用的蛋白质组成的蛋白复合物。DNA双链断裂可以使用许多方法定量，如脉冲场凝胶电泳、彗星测定法或Tunnel测定法。然而全部这些方法均显示相对低的灵敏度，这允许测定仅数个DSB/细胞。就彗星测定法而言，DSB可以与背景可靠区分的阈值是大约4Gy的辐射剂量。在这种辐射剂量，存在大约160个记录到的DNA DSB。通过免疫化学研究，已经显示可以使用免疫荧光法，通过测量YH2Ax灶点定量DNA DSB (13)。使用这种方法，用重离子辐射后和电离的光子辐射辐射后可检测灶点的数目与DNA DSB的预期数目和预期位置成正比。这种定量DNA DSB的方法足够灵敏，从而可以在微Gy范围内测量DNA DSB。使用免疫荧光法，通过丝氨酸139磷酸化的组蛋白H2Ax(YH2Ax)的染色来定量灶点，代表了相对新且灵敏的对电离辐射作用后大量DNA DSB定量的方法。涉及使用Y H2Ax检测DSB的全部实验的大多数涉及使用荧光显微术的免疫细胞化学实验和评价和/或分析。通过这种方法，除源自实验细胞系的细胞之外，来自患者的人单核细胞也已经在暴露于电离辐射后被测试。然而，该方法或使用免疫荧光显微术测定H2Ax灶点仍是相对地费时的，易受使用者偏好和技术设备的差异影响并且总体上是一种主观分析方法(14)。对于检测YH2Ax灶点，先前仅使用手工显微方法。使用智能软件算法的YH2Ax灶点的模式识别的描述目前限于一些学术研究(14，15)。这些研究展示了自动检测和评价YH2Ax灶点的可能性。然而，目前不存在适于用商用设置自动评价YH2Ax灶点的算法的证据。必须计数细胞中的灶点(光点)(从0至40)并且通过测试细胞中的有效数字验证结果(100个细胞/载玻片)。免疫荧光筛选方面的发展现状趋向于可以单独配置的模块化、灵活和紧凑系统，这使得测量标准化。自动化判读系本文档来自技高网...
【技术保护点】
用免疫荧光法自动测定细胞免疫荧光灶点的方法，包括：a.提供待分析的细胞和合成校正粒子的混合物，借以将细胞和粒子固定至固相，b.检测合成校正粒子，随后基于所述合成校正粒子的检测将荧光显微装置和自动化评价系统校正并对焦，c.将所述混合物与一种或多种结合至细胞的靶底物上的抗体温育，d.通过所述荧光显微装置检测与所述底物结合的抗体，以及e.使用所述自动化评价系统由所述荧光显微装置产生的图像数据测定免疫荧光灶点。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：迪尔克·罗根布克，
申请(专利权)人：MEDIPAN有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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