用于分离纯化的ＲＮＡ的试剂和方法技术

本发明专利技术提供了分离基本上不含ＤＮＡ、称为纯ＲＮＡ的完整ＲＮＡ的组合物和方法。可以分离任何来源（例如，人类、其他动物、植物、病毒等）的ＲＮＡ。在一个实施方式中，样品用ｐＨ值小于４的酚处理，并从水相中回收纯ＲＮＡ。在另一实施方式中，从含有少量有机溶剂的酸化样品中沉淀ＲＮＡ。公开了其他实施方式。通过调节ｐＨ，同样的本发明专利技术的组合物可以用于多种实施方式。通过本发明专利技术的方法得到的纯ＲＮＡ可以用于不希望ＤＮＡ污染的试验，例如，聚合酶链式反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于改善从生物学样品中分离纯化的RNA的组合物和方法。
技术介绍
纯的完整RNA的分离为分子生物学、临床和生物技术应用中分析基因表达的关键 步骤。为实现上述目标，已经开发了多种RNA分离的方法。最经常使用的用于RNA分离的 方法基于酚提取、从离液序列高的盐溶液中沉淀以及二氧化硅吸附(Ausubel等人，2002)， 参阅申请人的专利US4843155、US 5346994和US 5945515。在US 4843155中描述的方法通 常被称为单步(single-step)方法，用pH为4的酚-胍溶液(phenol-guanidinesolution) 提取RNA。该方法的有效和简便使单步方法成为最常用的分离RNA的方法。在申请人的US 5346994中描述的单步方法的改良方法允许通过pH为4-6的 酚-胍溶液的提取，从同一样品中同时分离RNA、DNA和蛋白质。均质处理生物学样品，并且 所得勻浆用诸如氯仿或溴氯丙烷的疏水有机溶剂进行相分离。然后离心，所得混合物分为 含有RNA的上层水相、相的界面和含有DNA和蛋白质的下层有机相。收集所述水相，用醇沉 淀并洗涤RNA。在US 4843155和US 5346994中描述的单步方法中，小心收集分层的水相对分离 RNA的质量很关键。少量的相的界面和有机相容易和水相一起转移，导致DNA和蛋白质污染 分离的RNA。并且水相的收集要求手工处理，成为实现单步方法自动化的障碍。US 4843155和US 5346994中描述的试剂和方法提供了基本纯的、未降解的RNA。 然而根据US 4843155和US 5346994分离的RNA含有残留量(residual amount)的基因组 DNA,可以通过反转录聚合酶链式反应测定法(reverse transcription-polymerase chain reaction assay, RT-PCR)检测。因此根据 US 4843155 和 US 5346994 分离出的 RNA 还必 须进一步纯化使其不含DNA(Guan等人，2003 ；Girotti和Zingg，2003)。所述污染基因组 DNA可以用作DNA聚合酶的母板(matrix)，产生另外的扩增产物并且扰乱RNA-依赖的反 转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。RT-PCR中的DNA污染只能通过使用一组含有基因组DNA 中外显子-内含子序列的引物而部分减轻，因为所述基因组DNA存在不含内显子的假基因 (pseudogene),使所述方法不可靠(Mutimer, 1998)。单步方法的改良已经改善了分离RNA的质量。在一种改良方法中，通过加入氯化 锂的沉淀步骤移除RT-PCR抑制剂(Puissant，1990 ；Mathy, 1996)。在另一改良方法中，在 盐存在下以醇沉淀RNA增加了分离RNA的纯度(Chomczynski，1995)。然而，所述这些改良 不能有效去除DNA污染。去除污染DNA的共同惯例是用脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease^Nase)处理 含有RNA的样品。在DNA酶处理后，所述含有RNA的样品随后用酚和氯仿萃取。在一种为了限制DNA污染的尝试中，于单步方法中包括了附加的DNA沉淀步骤。通过添加三分之一 体积的95%重量/重量乙醇，从水相中沉淀出所述污染的DNA(Siebert，1993)。乙醇的终 浓度为约24%重量/重量。该文作者指出，在所述低的乙醇浓度下，DNA沉淀而RNA仍然存 留在溶液中。RNA通过添加更多的乙醇从溶液中沉淀出来。然而，通过分析分离的RNA在 琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色的可见DNA带以及RT-PCR证明，所述方法得到的RNA仍然受 DNA污染。在另一种为了减少DNA污染并改善单步方法中RNA的质量的尝试中， Monstein(1995)在一种繁复的方法中，将酚提取的pH值提高到4. 1_4. 7，并用蛋白酶K处 理样品，然后再进行另一循环的酚提取、沉淀和醇洗涤。这一方法不仅耗时，而且仍然必需 用DNA酶处理以得到备用于RT-PCR中的不含DNA的RNA。从DNA中分离RNA也可以通过不加胍盐(guanidine salt)的pH为4的酚提取实 现(Kedzierski，1991)。然而，所述方法中不存在胍盐使得RNA对RNA酶(ribonuclease， RNase)敏感，因此降解了所述RNA。所述方法较近的改进使用了存在十二烷基硫酸钠的pH 4. 2的酚提取缓冲液(Chattopadhyay等人，1993)。RNA分离方法中，使用单步方法然后硅 柱(silica column)操作的结合也需要DNA酶处理(Bonham，1996)。所述双重纯化方法的 应用减少了 DNA污染，但是通过RT-PCR检测所得分离的RNA仍然存在基因组DNA。用于分 离RNA的另一方法使用了含有10%重量/重量至60%重量/重量的酚的单相水性溶液(US 专利申请20030204077)。不含离液剂(chaotrope)时，15%重量/重量至55%重量/重量 的一元醇(monoalcohol)、二元醇或者多元醇用于使酚保持在水性溶液中。因此，通过US 4843155和US 5346994中描述的方法分离的RNA中存在DNA残留 量，必需通过引入DNA酶处理而扩展所述操作。这样做由于操作的时间较长且在DNA处理过 程以及附加的纯化步骤中可能造成RNA不必要地降解，因此减少了所述方法的有用性。然 而从RNA制品中去除残留DNA为基于微阵列基因表达测定的RT-PCR所必需。前述分离RNA的方法，如US 4843155和US 5346994中所述，基于在pH为4或者 更高条件下进行的酚提取。以前单步方法的改良没有尝试通过进行PH低于4的酚提取改 善RNA质量。相反，首次用在US 4843155中的pH为4，在接下来的US 5346994中增加到 pH范围4-6。类似地^011计&11(1995)所述的方法酚提取的？11值升高到4.7。另一改善所 述单步方法的精心尝试提高了胍_酚提取的pH至5. 2 (Suzuki, 2003)。US 5973137中公开了 RNA分离的单步方法一种选择，使用非离液序列高的 (non-chaotropic)酸性盐。然而，所述单步酚提取法仍是用于RNA分离的最经常使用的 方法。描述单步方法的出版物(Chomczynski，1987)为 American Chemical Society and Institute for Scientific Information数据库中第四被引用最多的论文，以及近二十年 中出版的被引用最多的论文(CAS 2003，American Chemical Society)。因此需要提高分离RNA的纯度的新方法。
技术实现思路
本专利技术公开了能从生物学样品中分离基本不含DNA的RNA的试剂和方法，因此 易于用于反反(reverse transcriptasepolymerase chain reaction, RT-PCR)。所述RNA称为基本纯的RNA，为临床、研究以及其他应用中的基因表达合适诊断所必需。一种实施方式为使用酸性酚的相分离(phase本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从生物学样品分离纯化的ＲＮＡ的含酚单相组合物，该组合物包括当加入所述生物学样品时终浓度范围从约１０％重量／重量至约６０％重量／重量的酚以及足以维持所述生物学样品的ｐＨ范围在３．６至低于４．０的缓冲剂。

【技术特征摘要】
US 2004-4-16 10/826,113一种用于从生物学样品分离纯化的RNA的含酚单相组合物，该组合物包括当加入所述生物学样品时终浓度范围从约10％重量/重量至约60％重量/重量的酚以及足以维持所述生物学样品的pH范围在3.6至低于4.0的缓冲剂。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述缓冲剂选自醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、邻 苯二甲酸盐、酒石酸盐、乳酸盐或它们的混合物中的至少一种。3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包括至少一种核糖核酸酶抑制剂。4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包括酚的衍生物，所述酚的衍生 物选自苯基乙醇、丙烯苯氧基醇、百里酚、丁基酚或它们的混合物中的至少一种，所述酚的 衍生物终浓度上限为5%重量/重量。5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包括酚的增溶剂，所述酚的增溶 剂选自多元醇、一元醇和胍盐中的至少一种。6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包括浓度范围从1%重量/重量 至5%重量/重量的至少一种有机化合物，其足以增加所述组合物的密度。7.权利要求1所述的组合物，还包括去污剂。8.权利要求1所述的组合物，还包括无机盐或有机盐以及螯合剂。9.一种用于分离纯化的RNA的不含酚的水性组合物，所述不含酚的水性组合物包括至 少一种核糖核酸酶抑制剂以及选自醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐、乳 酸盐或它们的混合物中的至少一种缓冲剂，所述缓冲剂足以维持组合物的pH范围在3. 6至 低于4.0。10.权利要求9所述的组合物，还包括去污剂。11.权利要求9所述的组合物，还包括无机盐或有机盐以及螯合剂。12.一种从生物学样品中分离纯化的RNA的方法，该方法包括a)用包括终浓度范围从10%重量/重量至60%重量/重量的酚以及至少一种核糖核 酸酶抑制剂的试剂处理样品，b)将样品与至少一种疏水溶剂混合，维持pH范围为从3.6至低于4. 0，c)向水相中加入等体积水溶性有机溶剂以沉淀纯化的RNA，从水相回收纯化的RNA，以及d)洗涤并溶解所述沉淀的RNA。13.根据权利要求12所述的方法，其中，(a)中所述试剂还包括选自醋酸盐、柠檬酸盐、 磷酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐、乳酸盐或它们的混合物中的至少一种缓冲剂。14.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得科姆钦斯基，
申请(专利权)人：彼得科姆钦斯基，
类型：发明
国别省市：US[]