制备高免疫原性乙型肝炎疫苗的方法技术

制备通过两次接种能产生１００％抗ＨＢ↓［ｓ］之较高免疫原性乙型肝炎疫苗的方法，包括高度纯化羊衍生的高免疫抗ＨＢ↓［ｓ］（ＩＤ效价超过１∶４０９６），然后与琼脂糖凝胶结合以制得亲和层析柱，以亲和层析法纯化ＨＢ↓［ｓ］抗原阳性人血或分娩后胎盘血清，经过连续透析处理，从血清中除去含在其中的痕量杂蛋白，于９８℃－１００℃下对所说的样品加热３０分钟以完全失活ＨＢＶ，从而得到有更高免疫原性的、特异纯化的ＨＢ↓［ｓ］抗原蛋白质，后者被吸附到氢氧化铝凝胶上即可得到仅通过两次接种即能产生１００％抗ＨＢ↓［ｓ］的更高免疫原性的ＨＢ疫苗。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及使用亲和层析法，高度纯化含有具人血清蛋白结合活性(HSA-BA)之前S2蛋白的乙型肝炎表面(HBs)抗原，以制备能够产生100%抗HBs之乙型肝炎疫苗的方法。近年来，在美国、法国、日本及其他国家已开发了编码前S2的重组HB疫苗，但即使在3次重复接种后仍不能产生100%的抗HBs。本专利技术第一次阐明，如果以亲和层析法纯化含有具人血清白蛋白结合活性(HSA-BA)之前S2蛋白的HBs抗原，则有可能大量产生能够通过两次接种产生100%抗HBs的高免疫原性乙型肝炎疫苗。因此也就有可能完全排除在开发HBs疫苗中遇到的存在非反应者这一最大问题，以及以高技术制得的重组HB疫苗的缺陷。可借助免疫扩散法(ID)然后进行高度纯化由羊体内产生效价高于1∶4096的高免疫性抗HBs，然后将其吸附到用CNBr强活化的琼脂糖凝胶上以形成用于亲和层析的载体，其中所说的CNBr的浓度范围为50-600mg/ml，较好为50-300mg/ml，抗HBs为每100ml琼脂糖8000-10000单位(ID)，吸附时间为2-5小时。用5MMgCl2将未完全与所说的载体结合的蛋白质物质如抗HBs洗掉。从人血清或分娩后胎盘血清中收集含有具人血清白蛋白结合活性(PHA效价大于1∶64)之前S2抗gen(RPHA效价大于1∶512)的HBs抗原阳性血清(RPHA效价大于1∶1024)，然后用亲和层析法纯化之。然后用盐水和蒸馏水在4℃下将所说的纯化的样品连续透析2天，以使其中不再含有痕量高免疫抗HBs和羊衍生的IgG等。为了使包含在所说样品中的HBV完全失活，向样品内加入0.01-0.02%(体积)的化学物质如多氧-乙烯脱水山梨醇，并于98-100℃下热处理30分钟，然后再加入1∶2000的甲醛水溶液和1∶10000的merciolate，之后使所说的样品在37℃下失活96小时。通过0.45μm薄膜过滤所说的样品并使之完全吸附到氢氧化铝凝胶中，以形成有更高免疫原性的HB疫苗。实施方案1按照已知方法用libanol-硫酸铵纯化效价大于1∶4096(ID效价)的羊衍生的高免疫抗HBs。然后用Sepharose 6B(Phar-macia，Sweden)进行凝胶过滤。将300mg/mlCNBr加入到100mlSepharose 4B(Pharmacia，Sweden)中进行活化，再加入效价为8000(ID)的高免疫抗HBs，于室温搅拌下吸附2-5小时，然后用5MMgCl2洗2次，使1500ml含效价为1∶512(PHA)之HSA-BA，1∶512(RPHA)之前S2，1∶2048(RPHA)之HBs抗原的人血清吸附到连接了抗HBs的凝胶柱上(室温下吸附5小时)，用5M MgCl2洗脱以得到120ml含效价为1∶16384(RPHA)之前S2蛋白的HBs抗原溶液。所得样品分别用盐水和蒸馏水透析2天，用盐水稀释以使其效价(RPHA)变为1∶2048，然后加入吐温80使其终浓度达到0.02%，再于98℃下热处理30分钟。为使HBV完全失活，于98℃将样品热处理30分钟，然后加入甲醛水溶液(1∶2000)和0.01%的merciolate，并再于37℃下热灭活96小时。通过0.45μm薄膜过滤所说的样品，并使之完全被氢氧化铝凝胶吸附，以得到450ml有高免疫原性的HB疫苗。实施方案2用150mg/mlCNBr活化200ml Sepharose 4B，然后加入1200单位(ID)用DEAE纤维素(DE52，Whatman，England)高度纯化的抗HBs，以制成亲和层析柱。用亲和层析法纯化2000ml含1∶1024(PHA)之HSA-BA，1∶2048(RPHA)之前S2，1∶32768(RPHA)之HBs抗原的分娩后胎盘血清，以得到230ml含前S2蛋白的HBs抗原溶液(1∶65536RPHA)。连续用盐水和蒸馏水透析样品，然后加入吐温20使其终浓度达到0.015%，并于98℃下热失活40分钟。然后，再次失活、无菌过滤并用氢氧化铝凝胶吸附，以得到1800ml有高度免疫原性的HB疫苗。对按照本专利技术方法制得的所说疫苗成分的分析数据及其产生抗HBs效力如下所示。1.成分分析数据(经氢氧化铝凝胶吸附后直接纯化的样品)1).HBs抗原的效价大于1∶2048(RPHA);2)前S2蛋白效价大于1∶512(RPHA);3)HSA-BA效价大于1∶128(PHA);4)总蛋白量少于0.006%(60μg/ml);5)羊衍生的抗HBs其可用RIA或PHA法检测;即使以痕量存在，也只限于少至5mIU/ml的可忽视量;6)羊产生的正常IgG成分的含量即使以痕量存在，也只限于少至0.00000034%以下的可忽视量;7)正常人血清蛋白免疫电泳法测定为阴性。2.产生抗HBs的作用1)在接种者中产生抗HBs的效果在30个高免疫原性HB疫苗接种者中，在第二次接种(15岁以上的成年每次各接种1.0ml，儿童每次各接种0.25-0.5ml，两次间隔一个月，第三次接种在第90天进行)后，观察期间未显示任何付作用，没有出现抗HBs，也没有出现酶值(GPT，GOT)波动。另一方面，如表1中所示，在第二次接种后产生了100%的抗HBs。2)由编码前S2的重组HB疫苗和较高免疫原性HB疫苗产生抗HBs的情况已发现，虽然以重组DNA技术产生的酵母衍生之疫苗(Takeda，TGP-943T，Japan，1989)含有前S2蛋白，但在第二次接种后只产生47%的抗HBs，即使在第三次接种后也只产生92%的抗HBs(表2)。表 1较高免疫原性HBs疫苗产生抗HBs的作用 然而，已证明按照本专利技术方法产生的较高免疫原性HB疫苗只作两次接种即能够完全解决存在非反应者的问题。虽然已参照特定实施方案描述了本专利技术，但其详细内容并不构成对本专利技术的限制;很显然，对本领域技术人员可在本专利技术范围内作各种等同的改动或改进。权利要求1.用亲和层析法制备较高免疫原性HB疫苗的方法，其特征在于所说的方法包括将较高免疫原性羊衍生的抗HBs与琼脂糖凝胶结合以制备亲和载体，吸附、洗脱含有具人血清白蛋白结合活性(HBA-BA)之前S2蛋白的人血清式分娩后胎盘血清，用连续透析方法除去以痕量包含于其中的蛋白质，以及在98-100℃的高温度下完全失活HBV的步骤。2.根据权利要求1的制备较高免疫原性HBs疫苗的方法，特征在于在使较高免疫原性的羊衍生之抗HBs与琼脂糖凝胶结合以制备亲和载体的步骤中，所说抗HBs的效价保持在1∶4096(ID)以上。3.根据权利要求1或2的制备较高免疫原性HB疫苗的方法，特征在于在使较高免疫原性的羊衍生之抗HBs与琼脂糖凝胶结合以制备亲和载体的步骤中，被100ml琼脂糖凝胶吸附的抗HBs的总活性在8000-10000单位(ID)范围内。4.根据权利要求1、2或3的制备较高免疫原性HB疫苗的方法，特征在于在使较高免疫原性的羊衍生之抗HBs与琼脂糖凝胶结合以制备亲和载体的步骤中，人血清或分娩后胎盘血清的HSA-BA效价在1∶64(PHA)以上，前S2抗原在1∶512(RPHA)以上，HBs抗原效价为1∶1024(RPHA)。5.根据权利要求1、2、3和4的制备较高免疫原性HBs疫苗的方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
用亲和层析法制备较高免疫原性ＨＢ疫苗的方法，其特征在于所说的方法包括将较高免疫原性羊衍生的抗ＨＢ↓［ｓ］与琼脂糖凝胶结合以制备亲和载体，吸附、洗脱含有具人血清白蛋白结合活性（ＨＢＡ－ＢＡ）之前Ｓ２蛋白的人血清式分娩后胎盘血清，用连续透析方法除去以痕量包含于其中的蛋白质，以及在９８－１００℃的高温度下完全失活ＨＢＶ的步骤。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：高真南，李英爱，
申请(专利权)人：高真南，李英爱，
类型：发明
国别省市：KP[朝鲜]