一种大量产生β－聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉ＴＫＰＭ００００６及其培养方法技术

本发明专利技术提供了一种大量产生β－聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ?ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）ＴＫＰＭ００００６及利用该诱变菌株发酵生产聚苹果酸的方法，该菌株是以从我国宁夏回族自治区银川市王太堡果园土壤中筛选出的β－聚苹果酸生产菌ＴＫＰＭ１００１７的基础上采用多组复合诱变技术选育出的高产β－聚苹果酸的诱变菌株。在优化条件下β－聚苹果酸产量达到１８．４±１．３ｇ／Ｌ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于发酵工程
，具体涉及一株大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株 出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培养方法。
技术介绍
聚苹果酸是以苹果酸为唯一单 体的均聚高分子聚合物，是一种新型的完全生物降解性高分子材料。该种材料降解的产物 无毒无害，不会对环境产生二次污染，近年来这种高分子材料的开发研究得到了飞速发展。 PMLA主要有三种结构S卩α型、β型、γ型PMLA，唯一存在于人体内的只有β型PMLA。 作为一种脂肪族聚酯，PMLA具有高度的水溶性、生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、 无免疫原性和可化学衍生性，在药物方面具有很强的用途，可以作为药物载体用于心血管 及脑肿瘤方面的研究，还可作为微胶囊材料、生物医学材料如手术缝合线及伤口、烧伤治疗 的绷带等生物医学材料，直接用于人体，还可用于化妆产品及食品包装等材料。尽管早在20世纪60年代晚期就已发现聚苹果酸，但一直到20年后当它从几种生 物中分离出来时才受到了重视。1969年Shimada等发现一种由苹果酸组成的高分子化合 物能抑制圆弧青霉(Penicillium cyclopium)的酸性蛋白酶，当时酯键中的羧基位置还没 有确定，沉寂几年后，聚苹果酸在黏菌(physarumpolyc印halum)中被重新发现。而后几年 聚苹果酸的发展几乎处于停滞期，1989年Fischer等在黏菌(physarum polycephalum)中 再次发现聚苹果酸它是DNA聚合酶α的抑制剂。迄今为止，以Shimada，Fischer, Holler et al，Lee等为代表的国外学者对PMLA的性能，合成和应用做了较深入地研究，而我国 在这方面的研究相对较少，直到近几年才有学者对聚苹果酸的合成与性能做了基础性的研 究。因此加强聚苹果酸的研究，构建可降解生物高分子的一个研究平台，具有重要的理论价 值和应用价值。聚苹果酸的合成方法主要有化学法和微生物发酵法两种。化学合成法又分为直 接聚合和开环聚合两种。直接聚合法虽然步骤简单，产物分离提纯容易，产率较高，只是聚 苹果酸分子量低，反应温度较高，多为Y "PMLA,实际应用价值较低，而且催化剂有毒；开环 聚合法合成产物虽以聚苹果酸为主，但合成过程步骤较多产率低，中间产物分离提纯 繁琐；生物途径制备的聚苹果酸主要是通过微生物发酵合成，生物合成PMLA具有突出的优 点，产物均为β型、分子量高、生产条件温和、产物纯度较高，微生物发酵得到的PMLA分子 量可达200 760kDa，而化学法合成的分子量最多为174kDa，但微生物发酵生产PMLA产量 不高，而且极高的生产成本未能实现大规模的工业生产，以致影响了该物质的应用。本专利技术利用复合诱变技术筛选获得一株β -聚苹果酸高产菌株，并对培养基进行 优化，提高β-聚苹果酸的产量，有效降低了生产成本，实现了 聚苹果酸的工业化生产。
技术实现思路
本专利技术提供的方法与常规诱变方法相比筛选过程大为简化，工作效率更高的 β “聚苹果酸高产菌株的诱变方法，有效提高β “聚苹果酸产率。本专利技术解决该技术问题所采用的技术方案为1.采用多组复合诱变技术选育β-聚苹果酸高产菌株(1)选择生长良好的β -聚苹果酸生产菌株ΤΚΡΜ10017斜面菌种，用无菌生理盐水 洗下孢子，制做IO6个/mL的孢子悬浮液，于30W紫外灯下，30cm处，分别照射1、2、3、4、5、 6、7、8min，将菌悬液梯度稀释涂平板，避光培养，计算致死率；(2)根据(1)致死率选择高、中、低三个不同剂量的照射时间分别对菌株TKB016的 孢子悬浮液进行紫外照射处理；(3)然后把(2)三个不同照射时间的菌悬液混合均勻，梯度稀释涂平板，避光培养；(4)将(3)中的诱变菌株接种到以琥珀酸为唯一碳源的发酵培养基中培养；(5)将(4)中的种子液以10%接种量接种到以柠檬酸为唯一碳源的发酵培养基中培养；(6)将(5)中的种子液以10%接种量接种到以醋酸为唯一碳源的发酵培养基中培 养；(7)取(6)中的种子液接种到含CaCO3的固体培养基平板上培养，筛选培养基中 菌落大湿润、色泽黑亮、透明圈明显的菌株，即得高产聚苹果酸诱变菌株TKPM00006(该菌 株于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号 CGMCC No. 3337 ；分类命名出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)；保藏单位地址北京 市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)。2.出芽短梗霉TKPM00006的培养方法为(1)菌种活化将出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)TKPM00006 转接至 PDA 斜面培养基，25°C培养3 5d ；(2)种子培养选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子浓 度约IO6个/mL的孢子悬浮液，按10% (ν/ν)接种量接种装有IOOmL液体种子培养基的 500mL三角瓶中，25°C，200r/m条件下培养2 3d，制得种子液；(3)发酵培养将(2)中的种子培养液以8 10% (ν/ν)接种量接种于发酵培养 基中，在24 30°C下，200r/m振荡培养7 12d;3.出芽短梗霉TKPM00006所用到的培养基为(1)菌种活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA) 土豆200g/L，葡萄糖20g/L， 琼脂20g/L, pH 4. 0 4. 5，121 °C高压蒸汽灭菌15min ；(2)种子培养基葡萄糖 8%，丁二酸铵 0.3%，丁二酸 0.2%,K2CO3 0. 04%,KH2PO4 0. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7Η20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaCO3 2% (单独 灭菌)，pH 4. 5，121 °C高压蒸汽灭菌15min ；(3)发酵培养基葡萄糖 12%，丁二酸铵 0.3%，丁二酸 0.2%，K2CO3 0. 04%, KH2PO4 0. 01%, MgSO4 ·7Η20 0. 01%, ZnSO4 · 7Η20 5X 1(Γ4%，玉米浸出液 0· 05%，CaCO3 3% (单独灭菌)，pH 4. 5，121°C高压蒸汽灭菌15min ；(4)选择培养基①3% 琥珀酸，丁二酸铵 0. 3%，丁二酸 0. 2%，K2CO3 0. 04 %, KH2PO4 0. 01 %, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5 X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaC033% (单独灭菌)， pH 4. 5，121°C高压蒸汽灭菌15min ；②3% 柠檬酸，丁二酸铵 0. 3 %，丁二酸 0. 2 %，K2CO3 0. 04 %, KH2PO4 0. 01 %, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5 X 1(Γ4%，玉米浸出液 0. 05%，CaC033% (单独灭菌)， pH 4. 5，121°C高压蒸汽灭菌15min ；③3% 醋酸，丁二酸铵 0. 3%，丁二酸 0. 2%，K2CO3 0. 04 %, KH2PO4 0. 01 %, MgSO4 · 7H20 0. 01%, ZnSO4 ‘ 7H20 5X 1(Γ4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大量产生β－聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）ＴＫＰＭ００００６。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，钟堃，王凤荣，蒋磊，徐勇虎，贾士儒，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12[]