热对流聚合酶连锁反应之方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术提供以聚合酶连锁反应（ＰＣＲ）扩增核酸序列之方法及装置。该方法包含将ＰＣＲ样本置于容器内，该容器仅以单一热源加热，俾于ＰＣＲ样本底部提供变性反应用之高温，且由ＰＣＲ样本底部至ＰＣＲ样本表面渐减之温度梯度诱发热对流，致使炼合反应及延伸反应系于ＰＣＲ样本之不同区域自动发生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术系属以聚合酶连锁反应(PCR)扩增核酸序列之领域。更特定而言，本专利技术 系关于热对流PCR之方法及其装置。
技术介绍
以聚合酶连锁反应(PCR)扩增特定核酸序列已为成熟技术，且为医学及生物学研 究之有力工具。此生化反应过程需要三个主要步骤「变性反应」、「炼合反应」及「延伸反 应」，其各需不同之反应温度。现今商业化之PCR扩增技术所需样本包含欲扩增之模板DNA、 与模板DNA各股上特定序列互补之寡核苷酸引子对、热安定性DNA聚合酶、以及脱氧核苷三 磷酸(dNTP)。随后藉由反复加热与冷却样本，使样本在三种不同温度间循环，藉以扩增模板 DNA核酸序列之特定部分。PCR之第一步骤为变性反应，其系将样本加热至高温，俾使双股之模板DNA分离成 为单股DNA。第二步骤为炼合反应，其系将样本冷却至较低温度，俾使引子与第一步骤所形 成之单股DNA结合，形成DNA与引子之复合物。最后步骤为聚合(延伸)反应，其系将样本 维持于适当温度，藉由DNA聚合酶之作用，使DNA与引子之复合物中之引子得以延伸，从而 产生与模板DNA各股互补之新单股DNA。每一次由上述三步骤组成之循环可复制两份引子 结合位置间之DNA序列。典型地，将包含变性反应、炼合反应及延伸反应等三个温度各异之 步骤的PCR循环重复约20至40次，可生产出数百万个标的核酸序列之复制物。变性反应之温度典型地系介于90至94°C之范围。炼合反应之温度系依据所用引 子之解链温度(melting temperature ；Tm)而选择，典型地系介于35至65°C之范围。聚合 反应之典型温度为72°C，这是由于最常用之DNA聚合酶，即Taq DNA聚合酶(一种萃取自 Thermus aquaticus之热安定性DNA聚合酶)，在该温度下活性最佳。由于Taq DNA聚合酶 具有广泛之温度范围，因此其亦可使用仅有两个步骤之温度循环，其中聚合温度与炼合温 度几乎相同。在传统之市售PCR仪器(亦即热循环仪器)中，样本之温度系以热传导方式控制。 简言之，令含有PCR样本之反应容器与具有高导热性之固体金属块接触。该金属块与加热 及冷却装置相连，使其可改变温度，以达到所需温度。采用该方法之传统PCR仪器通常使用 具极高导热性之镀金银块及/或珀耳帖(Peltier)冷却方法，以达成迅速之温度改变。然 而，传统之热循环PCR并非有效率之程序，因其尚需花费额外的时间及能源去加热及冷却 PCR样本本身以外的物质。此外，由于机器本身精密的特性，因此热循环仪器通常十分昂贵。热对流PCR方法系于具有两个温度控制组件之装置上进行PCR(Krishnan，Μ.等 人，2002，Science 298 793)。Benett 等人在美国专利第 6，586，233 号(2003 年 7 月 1 日 核准)中揭示了热对流PCR(CPCR)之方法及装置，其中由热对流驱动之样本溶液在一侧加 热之封闭0形槽内循环流动。Hwang等人在美国专利申请案第10/801，342号(2004年3月 15日公开，公开号2004/0152122)中揭示了热对流PCR之方法及装置，其使用复数个热源， 以在样本溶液中维持不同温度之区域，使得当样本在各区域间循环时，PCR的三个步骤可依序并重复地发生。虽然已经提供一些热循环PCR之方法，但其所需之装置包含复杂的结构且十分昂 贵，因而阻碍其在商业上的应用。目前仍需更方便且实用之热对流PCR(CPCR)方法及装置。
技术实现思路
本专利技术提供可方便、有效率且经济地进行热对流PCR(CPCR)之新颖方法及装置。因此，在第一方面，本专利技术提供一种以聚合酶连锁反应(PCR)扩增标的核酸序列 之方法，包含步骤(1)提供管状容器；(2)将PCR样本置于该管状容器内，其中该PCR样本包含具有欲扩增之标的核酸 序列的模板DNA、脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸 (dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)及至少二种具有互补于标的核酸 序列之3’端的序列之寡核苷酸引子，其中该等引子系经设计为具有介于40°C至约90°C间 之解链温度(Tm)；(3)将该容器之底部埋置于热源中，然后加热该PCR样本，使引子解链，并于稳定 维持PCR样本表面温度(Ts)低于引子之解链温度(Tm)至少约2°C，因而造成由PCR样本底 部至顶部渐减之温度梯度，该梯度诱发热对流并致使下列事件依序并重复地在样本之不同 区域中发生(i)变性反应，其中双股之模板DNA分离成为两条单股DNA，(ii)炼合反应，其 中引子与单股DNA杂交形成DNA与引子之复合物，及(iii)聚合(延伸)反应，其中DNA与 弓I子之复合物中之引子藉由DNA聚合酶而延伸。在第二方面，本专利技术提供一种藉由本专利技术方法以聚合酶连锁反应(PCR)进行核酸 序列扩增之装置，包含(i)单一热源；(ii)在其中进行PCR之一或多个管状容器；及(iii) 支持物，其具有使累积于多个容器间之热量均勻化之构件。附图说明上述
技术实现思路
及以下具体实施方式与所附图式一并阅读将更增了解。为达阐明本 专利技术之目的，图式中所示具体实例为目前较佳者。然而，应了解本专利技术并不限于所示之特定 排列及结构。在图式中图1为根据本专利技术之CPCR的理想单一循环热对流图解，其中X轴代表时间尺度， Y轴代表温度尺度，10,20及30表示PCR中所发生的三个事件(分别为变性、炼合及延伸) 之温度范围；图IA显示根据本专利技术之CPCR的PCR样本之温度变化，图IB显示传统PCR的 PCR样本之温度变化，以供比较。图2为显示实例1之PCR结果之影像，其中第1道及第2道代表使用相同样本及 程序的两次重复实验结果，而第3道则代表负对照组之结果。图3为显示实例2之PCR结果之影像，其中标示为「CPCR」之各道为依据本专利技术方 法之PCR样本之结果，所使用引子对之解链温度(Tm)如各道上端标示之数字，PCR样本之表 面温度则为68°C ；而标示为「传统PCR」之各道则为相同样本但使用传统PCR方法之结果， 以供比较。5图4为依据本专利技术之装置(具有均热器)之具体实例的图像。图5显示实例3之CPCR结果，使用本专利技术之CPCR方法及具有或不具有均热器之 装置；其中图5A显示样本位置之编号；图5B显示无均热器之装置的CPCR结果；图5C显示 有均热器之装置的CPCR结果。图6显示实施依据本专利技术之CPCR方法的PCR样本之表面温度(Ts)变化，样本位 置如图5A中位置编号1-8所示，分为二组，分别为使用具有或不具有均热器之装置；其中曲 线A(- -)代表使用无均热器之装置之组别的变化，曲线B(- ■-)代表使用有均热器之 装置之组别的变化。具体实施方式本专利技术提供进行热对流PCR之新颖方法及装置。本专利技术之具体实例为一种以PCR扩增标的核酸序列之方法，包含步骤(1)提供管状容器；(2)将PCR样本置于该管状容器内，其中该PCR样本包含具有欲扩增之标的核酸序 列的模板DNA、DNA聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷 酸(dGTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)及至少二种互补于标的核酸序列之3’端之序列的寡核 苷酸引子，其中该等引子系经设计本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以聚合酶连锁反应（ＰＣＲ）扩增标的核酸序列的方法，其特征是包含步骤：（１）提供管状容器；（２）将ＰＣＲ样本置于该管状容器内，其中该ＰＣＲ样本包含具有欲扩增之标的核酸序列的模板ＤＮＡ、ＤＮＡ聚合酶、脱氧腺苷三磷酸（ｄＡＴＰ）、脱氧胞苷三磷酸（ｄＣＴＰ）、脱氧鸟苷三磷酸（ｄＧＴＰ）、脱氧胸苷三磷酸（ｄＴＴＰ）及至少二种具有互补于标的核酸序列之３’端之序列的寡核苷酸引子，其中该等引子系经设计为具有介于４０℃至约９０℃间之解链温度（Ｔｍ）；及（３）将该容器之底部埋置于热源中，然后加热该ＰＣＲ样本，使引子解链并于容器中之ＰＣＲ样本表面维持稳定温度（Ｔｓ），该温度低于该引子之解链温度（Ｔｍ）至少约２℃，因而造成由ＰＣＲ样本底部至顶部渐减之温度梯度，藉此诱发热对流并使下列事件在ＰＣＲ样本之不同区域依序并重复地发生：（ｉ）变性反应，其中双股之模板ＤＮＡ分离成为两条单股ＤＮＡ，（ｉｉ）炼合反应，其中引子与单股ＤＮＡ杂交形成ＤＮＡ与引子之复合物，及（ｉｉｉ）聚合反应，其中ＤＮＡ与引子之复合物中之引子藉由ＤＮＡ聚合酶而延伸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2008-1-24 61/023,219一种以聚合酶连锁反应(PCR)扩增标的核酸序列的方法，其特征是包含步骤(1)提供管状容器；(2)将PCR样本置于该管状容器内，其中该PCR样本包含具有欲扩增之标的核酸序列的模板DNA、DNA聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)及至少二种具有互补于标的核酸序列之3’端之序列的寡核苷酸引子，其中该等引子系经设计为具有介于40℃至约90℃间之解链温度(Tm)；及(3)将该容器之底部埋置于热源中，然后加热该PCR样本，使引子解链并于容器中之PCR样本表面维持稳定温度(Ts)，该温度低于该引子之解链温度(Tm)至少约2℃，因而造成由PCR样本底部至顶部渐减之温度梯度，藉此诱发热对流并使下列事件在PCR样本之不同区域依序并重复地发生(i)变性反应，其中双股之模板DNA分离成为两条单股DNA，(ii)炼合反应，其中引子与单股DNA杂交形成DNA与引子之复合物，及(iii)聚合反应，其中DNA与引子之复合物中之引子藉由DNA聚合酶而延伸。2.如权利要求1所述的方法，其特征是进一步于步骤(2)之后包含将油加入容器中之 样本上方以密封样本之步骤，其后为步骤(3)。3.如权利要求1所述的方法，其特征是PCR之各参数PCR样本之总体积(V，单位为 μ 1)、PCR样本之黏度(μ，单位为Ns/m2)，容器之内直径(d，单位为mm)，以及容器中之PCR 样本之表面温度(Ts，单位为。C )，其系由下列公式决定V = (AXTs+B-500 μ +0. 7) X e(L 86+100u)d其中A值介于-0. 019与-0. 016之间，且B值介于1. 85与2. 27之间。4.如权利要求3所述的方法，其特征是A值为-0.01812而B值为2. 1。5.根据申请专利范围第1项之方法，其特征是PCR样本之表面温度系介于约40°C与约 80°C之间。6.如权利要求1所述的方法，其特征是PCR样本之...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈培哲，陈炳辉，周文彬，谢一帆，叶秀慧，
申请(专利权)人：基亚生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[]