一种柔嫩艾美耳球虫热激蛋白６０基因及其克隆、表达与应用制造技术

本发明专利技术公开了柔嫩艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ）的一种新热激蛋白６０（Ｅｔ　ＨＳＰ６０）基因，克隆号：ＺＢ２－Ｄ０７，全长１８０２ｂｐ，含有一个１４５５ｂｐ的完整开放阅读框（ＯＲＦ），编码４８４个氨基酸（Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＦＪ９１１６０５）。本发明专利技术将该基因连接到原核表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋），构建了原核表达重组质粒ｐＥＴ２８ａ（＋）－Ｅｔ　ＨＳＰ６０，并在大肠杆菌系统中进行了表达。通过纯化重组蛋白ｐＥＴ２８ａ（＋）－Ｅｔ　ＨＳＰ６０进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，再转移至ＰＶＤＦ膜上，用Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ卵囊口服免疫鸡的抗血清作为一抗，羊抗鸡ＩｇＧ作为二抗进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析，表明它有一定的抗原性，能用于制备抗鸡球虫病药物和制备抗鸡球虫病疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术，具体涉及一种新的柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)热激蛋白 (Heat shock proteins，HSPs)60 (Et HSP60)基因的克隆、表达及应用。
技术介绍
鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害严重的全球性寄生虫病， 给养鸡业造成巨大的经济损失。目前控制球虫病的主要方法包括化学药物防治和疫苗免疫 预防，但由于这些方法存在安全、价格以及抗药虫株出现等问题，迫切需要寻找新的防治手 段来控制球虫病。而研制高效安全的抗球虫病基因工程疫苗和新药物的关键在于寻找虫体 抗原基因。本专利技术人以对鸡危害最严重的柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)为研究对象，开展 了 E. tenella孢子生殖发育阶段差异表达基因的分离、鉴定等研究，为探索鸡球虫的入侵 和生长发育机制，研制高效、安全的抗球虫疫苗和新药物奠定基础。热激蛋白(Heat shock proteins, HSPs)是指所有原核生物和真核生物在生长发 育或受到不同理化及病理因素刺激时，机体内新合成或表达量增加的一组蛋白质家族，属 非分泌型蛋白质。热激蛋白是物种种系发生中结构和功能最为保守的一类蛋白质，同时也 是分子伴侣(Molecular chaperone)中最重要的一类蛋白。热激蛋白的主要生物学功能是 帮助相关蛋白质的折叠(Folding)、移位(Translocation)、复性(Renaturation)和降解 (Degradation)，以保护生物体细胞免受内外不良因素的损害。热激蛋白能产生一系列相应 的生理反应，减缓细胞的损伤，其功能主要包括1)防止蛋白质在受到物理或化学刺激时 产生沉淀；2)作为分子伴侣协助蛋白质在细胞器之间转运；3)协助新生肽链折叠，并阻止 折叠时发生错误；4)作为DNA水解酶在碱基错配时协助修复DNA结构；5)调节其他蛋白质 的合成与功能，参与细胞的生长、发育和分化；6)作为一种重要抗原被免疫系统识别，参与 抗原的加工和递呈。热激蛋白具有以下特点1)在热休克状态下优势表达，而其他蛋白表 达受抑制；2)在所有细胞中均表达；3)其氨基酸序列在进化中高度保守；4)平时HSPs主要 存在于细胞质中，应激时HSPs迅速进入细胞核和核仁，应激恢复期又迅速进入细胞质，当 再次应激时HSPs又返回细胞核；5)HSPs可以提高抗应激能力，HSP70生成量与细胞耐热力 成正相关；6)在其基因启动子上游具有热休克元件，能被特定的热休克因子启动而表达。 HSPs在细胞内的含量相当高，约占细胞总蛋白的5%，其功能也涉及细胞结构的维持和更 新等。本专利技术人研究发现克隆的柔嫩艾美耳球虫新热激蛋白60 (Et HSP60)基因编码的蛋白具有一个HSPs家族ClpB的保守结构域(ClpB_D2-small)，且该基因编码的氨基酸有 ATP结合位点(ATP binding site)，故其可能在ATP酶的水解过程中起到了重要作用，有分 子伴侣的功能。将测得的核苷酸序列结果与柔嫩艾美耳球虫基因组测序网站QliMlZZll^ sanger. ac. uk. /proiects/E tenella/OmniBLAST)进行同源性搜索比对，发现该基因与柔 嫩艾美耳球虫基因组的HSP基因有高度同源性。在GenBank中进行Blast搜索，未发现与之比配的柔嫩艾美耳球虫基因序列，表明该基因是柔嫩艾美耳球虫的新基因，按其分子量 大小命名为Et HSP60基因。利用荧光定量PCR验证该基因在E.tenella不同发育阶段虫 体中的表达情况，结果发现Et HSP60基因在子孢子发育阶段的转录拷贝数最高，提示该蛋 白可能与柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞有关。 HSP60在其他物种作为一种分子伴侣其重要的生物功能已日益引起人们的重视， 特别在保护免疫应答的特异性靶标上起重要作用。另外，HSP60在真菌、线粒体、叶绿体中 还协同HSPlO参与蛋白的折叠并将其转运到其他的细胞器中。研究发现不同物种的HSP60 有高度保守性。由于HSP60在许多病原体传染过程中都是一种免疫优势抗原，因此未来的 研究有可能会阐明HSP60在自身免疫发展中的作用，以及以HSP60为基础的免疫治疗发展 中的作用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于研究扩增柔嫩艾美耳球虫的一种新热激蛋白 60 (EtHSP60)基因及其应用。本专利技术提供了一种柔嫩艾美耳球虫热激蛋白60(EtHSP60)基因，该基因具有以下 序列TCAGATGTGCATTTAAGGCGATTTGAATAAGCTTGTGGGGGCCACGACTTTGGAAGAGTATAAACTCCACATTGAAAAGGACGCGGCCTTTTGCCGCCGCTTCCAGAACATCGTCGTGGAGGCGCCCAGCAAGGAGAAGGCCCTTTCAATCCTGCAAAG AGTGCGTCCGCACTACGAGCAGTTCCACCAGCTGGAAATCCCGGAAGAAGTGCTGGAGGCGGTGACGAACATGTCGGACCAGTACGTGAAGCAGCGGGCCTTTCCCGACAAGGCGCTGGACCTCCTCGACGAGTCTTGTTCTTGGAAACGCGTTTCCCACAACAAAAAAATAAATGTCCCCAACAAGCAGATCGCGCAGCTCAAGAAGAACAAGCTCCCCGAGGAAGAAGAGGAGCTGAAGAAACTGCAGGAGGAGTTGGCTGCTCTCGAGGCGCTCACTGCGGGGGGGCGGCGGCTGGTGCTGGAGACCAACGACGTGGCCCACATCTTGAGCCAGTGGACTGGAATCCCGATGGGCAAAATGACGGAAGACGAAGTCTCGCGGGTGTTGAGGCTCGCCGACATTTTGTCTCTGAGGGTTGTTGGACAAGACCGAGCAGTGAAGGCCGTGGCCGACGCGCTGGCTATTCAGCGCGCGGGGCTGAGTCCGAAGAACAAGCCGCTGGGCACTTTCCTGTTCCTGGGGTCTTC GGGGGTGGGCAAGACGGAGCTGGCGAAGGCGGTGGCCGAGGAAATGTTTGACTCTGAAAAGAACTTAATCAGACTGGACATGGTGGAATATCAAGAAGCCCACAGCATTTCGCGGCTGATCGGCCCGCCGCCGGGCTACATGGGCAACGACGAGGGCGGGCAGCTCACGGAGGCCGTGCGCCAAAAGCCCCACAGCGTGGTGTTGTTCGACGAAGTCGAAAACGCGCACAAGAACTTGTGGTCTTTGCTGCTGCCGATGCTGGACGAGGGCCACCTGTCGGACTCGAAGGGAAACCGGGTGGACTTTACGAATTGTTTGATAATTTTGACTTCCAATATTGGCCAGCAGTACATTTTGGACAGTTACAAGGAAGTGCGGGCGCTGACGGCTGGCAACGAGAAGGACAAGGCCAGCAGCAACGGCAGCAGCAGCAGCAACGGCGAAGAGCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柔嫩艾美耳球虫热激蛋白６０基因，其特征在于所述柔嫩艾美耳球虫热激蛋白６０基因具有以下序列：　　ＴＣＡＧＡＴＧＴＧＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＧＡＴＴＴＧＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＴＴＴＧＧ　　ＡＡＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＣＣＡＣＡＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＡＧ　　ＡＡＣＡＴＣＧＴＣＧＴＧＧＡＧＧＣＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＡＡＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧ　　ＡＧＴＧＣＧＴＣＣＧＣＡＣＴＡＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＣ　　ＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧＡＡＣＡＴＧＴＣＧＧＡＣＣＡＧＴＡＣＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＣ　　ＧＡＣＡＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＣＧＡＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＣＡＣ　　ＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＣＣＣＣＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＣＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡ　　ＡＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＧＣＴＧＣ　　ＴＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＡＣＧＡＣＧ　　ＴＧＧＣＣＣＡＣＡＴＣＴＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＡ　　ＧＡＣＧＡＡＧＴＣＴＣＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＴ　　ＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＧＣＧＣＧＣ　　ＧＧＧＧＣＴＧＡＧＴＣＣＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＣＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＴＣＴＴＣ　　ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧＡＣ　　ＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧ　　ＣＡＴＴＴＣＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＴＡＣＡＴＧＧＧＣＡＡＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＧ　　ＧＧＣＡＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＧＣＣＧＴＧＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＣＧＡＣ　　ＧＡＡＧＴＣＧＡＡＡＡＣＧＣＧＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧ...

【技术特征摘要】
一种柔嫩艾美耳球虫热激蛋白60基因，其特征在于所述柔嫩艾美耳球虫热激蛋白60基因具有以下序列TCAGATGTGCATTTAAGGCGATTTGAATAAGCTTGTGGGGGCCACGACTTTGGAAGAGTATAAACTCCACATTGAAAAGGACGCGGCCTTTTGCCGCCGCTTCCAGAACATCGTCGTGGAGGCGCCCAGCAAGGAGAAGGCCCTTTCAATCCTGCAAAGAGTGCGTCCGCACTACGAGCAGTTCCACCAGCTGGAAATCCCGGAAGAAGTGCTGGAGGCGGTGACGAACATGTCGGACCAGTACGTGAAGCAGCGGGCCTTTCCCGACAAGGCGCTGGACCTCCTCGACGAGTCTTGTTCTTGGAAACGCGTTTCCCACAACAAAAAAATAAATGTCCCCAACAAGCAGATCGCGCAGCTCAAGAAGAACAAGCTCCCCGAGGAAGAAGAGGAGCTGAAGAAACTGCAGGAGGAGTTGGCTGCTCTCGAGGCGCTCACTGCGGGGGGGCGGCGGCTGGTGCTGGAGACCAACGACGTGGCCCACATCTTGAGCCAGTGGACTGGAATCCCGATGGGCAAAATGACGGAAGACGAAGTCTCGCGGGTGTTGAGGCTCGCCGACATTTTGTCTCTGAGGGTTGTTGGACAAGACCGAGCAGTGAAGGCCGTGGCCGACGCGCTGGCTATTCAGCGCGCGGGGCTGAGTCCGAAGAACAAGCCGCTGGGCACTTTCCTGTTCCTGGGGTCTTCGGGGGTGGGCAAGACGGAGCTGGCGAAGGCGGTGGCCGAGGAAATGTTTGACTCTGAAAAGAACTTAATCAGACTGGACATGGTGGAATATCAAGAAGCCCACAGCATTTCGCGGCTGATCGGCCCGCCGCCGGGCTACATGGGCAACGACGAGGGCGGGCAGCTCACGGAGGCCGTGCGCCAAAAGCCCCACAGCGTGGTGTTGTTCGACGAAGTCGAAAACGCGCACAAGAACTTGTGGTCTTTGCTGCTGCCGATGCTGGACGAGGGCCACCTGTCGGACTCGAAGGGAAACCGGGTGGACTTTACGAATTGTTTGATAATTTTGACTTCCAATATTGGCCAGCAGTACATTTTGGACAGTTACAAGGAAGTGCGGGCGCTGACGGCTGGCAACGAGAAGGACAAGGCCAGCAGCAACGGCAGCAGCAGCAGCAACGGCGAAGAGCCCGGCAAGTCCTCCTTCAAAGGCACGGGCAAATCCCCCAAAGACATTCTCCGGAGAATGCGCCAGAAGGTTCTTAAGGAGGTCTTCGGCTACTTCAAGCCGCAGGTCATCGGCAGGATGAGCGAGATCATCATATTTGAGCCTCTGGGGGAAACCGCCATGAAGGGGGTTTTGAACTTGAAGCTTTCGGCGCTGCGGAACAGTTTAGCAGCAAAAGGAATTGACTTCAAAGTCGCCGACTCCGCCCTGGGCTACATCTTGGAAAGGGCCTGGTCCCACAAGTTCGGAGGCCGCAGAATGGCCAAGTACCTGGAGAAGTACATAAAGCCCCGAGTGGCGCCGCTTTTGATTTCCGGCAAACTCAAGGCGGGAGACAGAGCCGTCTTGGCGCGCTCCAACACAAACCCCAATCAGCTCAACTTGATTGTGTGCGAGCTGAACGAAGAAGGCGTTTGCAAGCCGGGAACGAAGTACGGCACGAAGCTGGTCACGCAGGAAGTGAAGCCGCAGGACGGAAACGAGGATGAAGAGGACGCAATGGACTAGCAAAAGAATTAAAAGCATTTAAAACATTTAAATGATGCTTTTTATCCCTGGAAAGCGGAGAGACAAAGTGAGGAAATGAGGACGGAGCTCCCGTTTTTGGCTACCGTGAGGCAACTGA所述ATG为起始密码子；TAG为终止密码子。2.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫热激蛋白60基因，其特征在于所述基因全长1802bp，含1455bp的开放阅读框，编码484个氨基酸；所述基因编码的氨基酸具有一 个HSPs家族ClpB的保守结构域，与E. tenella基因组的HSP基因有高度同源性。3.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫热激蛋白60基因，其特征在于所述基 因具有2个酰胺化位点、lfN端糖基化位点、1个ATP/GTP结合位点、1个cAMP和cGMP依 赖的蛋白激酶磷酸化位点、4个酪蛋白激酶II磷酸化位点、6个N端豆蔻酰基化位点、10个 PKC磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、1个核定位序列和1个NACHT结构域。4.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫热激蛋白60基因，其特征在于所述基因 的蛋白N-端不具有信号肽，也无跨膜结构；在溶液中的不稳定指数为41. 86，高于域值40， 在溶液中性质不稳定；脂肪族指数90. 68，总亲水性-0. 430，蛋白质总体疏水性较高。5.一种如权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫热激蛋白60基因的克隆和表达方法，其特征 在于该方法包括下列步骤(1)试剂与材料Trizol、GeneRace Kit ；TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit、限制性内切酶； pGEM-T-easy vector ;DEPC、X_Gal、Tag Plus I DNA 聚合酶；bacto-yeastextract、AgarA、 bacto-tryptone ；丙烯酰胺、N，N ‘_亚甲基甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵；HRP-羊抗 兔IgG3 ；HRP-羊抗鸡IgG ；蛋白质预染Marker ；High-AffinityGST Resin ；罗曼优质黄羽 鸡；柔嫩艾美耳球虫；pET28a(+)表达载体、大肠杆菌T0P10、大肠杆菌BL21DE3 ；(2)方法①柔嫩艾美耳球虫子孢子的收集从4°C冰箱取出保存的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，室温离心，洗去重铬酸钾溶液后， 计数孢子...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩红玉，黄兵，颜彦，赵其平，董辉，姜连连，周杰，李洋，郭涛，平宪卿，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]