治疗癌症的混合反义药物制造技术

本发明专利技术提供一种治疗癌症的混合反义药物，它由三种反义核苷等重量混合而成，三种反义核苷的ＤＮＡ序列分别是：５’ＣＡＣ ＣＧＡ ＧＧＧ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＴ３；５’ＡＧＧ ＴＡＧ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＧＧ ＡＣ３；５’ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＡＴ３。它是利用三个反义核苷来攻击三个有机互作用的多个肿瘤基因ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｍｙｃ和ｂｃｒ－ａｂｌ，抑制作用强，抑制效果持久，可作为白血病细胞的生长和增殖的抑制剂。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物技术治疗药物，特别是涉及一种治疗癌症的混合反义药物。反义核苷(Antisense)是90年代诞生的一种新型生物技术治疗药物，该药物特异地、选择性地攻击引起疾病的基因其特定的碱基序列，从而阻断其活性和某种蛋白质的合成，最终达到治疗效果。反义核苷作为生物技术治疗药物已被公认。许多研究表明，在众多肿瘤病变发展过程中涉及到许多基因的协同作用，包括bcr-abl,p53,c-myc,c-myb等，其它白血病类型的模型也证明bcr-abl与c-myb基因间的协同作用造成细胞肿瘤化，所以单一反义核苷的抑制作用不足以抑制整个肿瘤细胞的繁殖作用性。本专利技术的目的在于提供一种尤其对白血病细胞有更强抑制作用且抑制效果持续更久，可作为白血病细胞繁殖的抑制剂的治疗癌症的混合反义药物。本专利技术治疗癌症的混合反义药物是由三种反义核苷等重量混合而成，三种反义核苷的DNA序列分别是c-myc反义核苷5’CAC CGA GGG GTC GAT GCACT3；c-myb反义核苷5’AGG TAG CAT CTT CAG GGGAC3；bcr-abl反义核苷5’CTG AAG GGC TTC TTC CTTAT3。本专利技术治疗癌症的混合反义药物中的三种反义核苷合成是采用修饰过的固相磷酸硫代合成方法(Phosphorothioate)，利用先进的核酸合成仪自动合成，其基本原理是，根据氰乙基磷酸胺化学合成程序，即把起始核苷的3’端通过连接链接到固相载体上，从此末端开始逐步接长寡核苷酸链，每接长一个核苷，则为一个反应循环。接长的寡核苷酸链一直固定在固相载体(DMP CPG)上。过量的反应物及副产物，通过乙腈洗涤除去。当寡核苷酸合成到所需长度后，它将被从固相载体上切除下来，然后再脱出保护基，分离纯化，最终得到所需产物。每个所接的核苷都需经过保护、脱保护、缩合、戴帽、氧化的循环过程。本专利技术为20碱基，需要经过20个循环才能完成。其合成反应通过磷酸酯和羟基的缩合而形成3’,5’-磷酸二酯链。对于反义核苷的合成，采用硫代替磷以保护其结构在生物体内不被核酸酶所降解。合成的反义核苷经反相高压液相层析(RHPLC)纯化，其纯化度可达98％以上，最终产品冷冻干燥后贮存于4～-20℃暗处。本专利技术治疗癌症的混合反义药物是一种治疗效果特异的新型分子药物，与传统药物的特性相比，其优点在于利用多个反义核苷来抑制相互联系的多个肿瘤基因活性，使其每个反义核苷的部分抑制效果得到累加，其结果达到高效的协同抑制作用，而且其抑制活性大大延长，对正常细胞无明显毒性，适用于进一步的人体实验，作为治疗人体各种肿瘤疾病，尤其对白血病是一种新的途径和方法。下面结合附图详细说明本专利技术实施例制备及性质。附图说明图1核酸杂交法电泳2对人体血液细胞生长的抑制作用MTT法鉴定3对人体K562肿瘤细胞植入SCID小鼠后小鼠存活率分析图实施例1本专利技术治疗癌症的混合反义药物由三种反义核苷等重量混合而成，三种反义核苷的DNA序列分别是c-myc反义核苷5’CAC CGA GGG GTC GAT GCACT3；c-myb反义核苷5’AGG TAG CAT CTT CAG GGGAC3；bcr-abl反义核苷5’CTG AAG GGC TTC TTC CTTAT3。本专利技术治疗癌症的混合反义药物合成工艺流程如下(一)本专利技术治疗癌症的混合反义药物中各反义核苷的合成。1、本专利技术由美国Applied Biosystems公司出品的ABI392全自动DNA合成仪自动合成，合成条件严格按照该机的操作手册进行，所得粗产品，收集在4毫升的玻璃瓶内。2、合成粗产品用真空离心方法(42℃)使氢氧化铵挥发，并用酒精萃取两次，乾燥后溶于10mM Tris-HCl·0.4mM EDTA(PH7.6)的缓冲液中。3、使用FPLC离子交换层析柱，型号MonoQHR5/5PH12.5(从Phamacia购买)进行提纯，去离子和盐。提纯前、后的分析监定如图1、图2所示。4、提纯后的产品在冷冻干燥器内降温和去水，冷冻干燥，得反义核苷白色粉末，于0～20℃储存。其中合成原料β氰乙基DNA磷酰胺(美国Applied Biosystems)腺苷(美国Synthegen)鸟苷(美国Synthegen)胸腺嘧啶苷(美国Synthegen)胞嘧啶苷(美国Synthegen)乙睛(美国Applied Biosystems)腺苷磷酰胺(美国Applied Biosystems)四氮唑(美国Applied Biosyslems)氢氧化铵(美国Applied Biosystems)盖髓物试剂醋酸酐/二甲基吡啶/四氢呒喃氧化反应试剂四乙基硫代硫化物/水/吡啶/四氢呒喃脱三苯甲基作用试剂三氯醋酸/二氯甲烷1号瓶(装有腺苷磷酰胺)乙睛流量1.7毫升/分，用于控制和校准磷酰胺和四唑的流速。18号瓶(装有乙睛)乙睛流量1.8毫升/分，用于控制和校准盖髓物试剂，四乙基硫代硫化物，三氯醋酸和乙睛流量。合成柱孔径1000唉玻璃柱，0.2微摩尔流量控制孔。柱上合成步骤如下1、脱保护核苷酸是一个多功能团的化合物，在合成中除了反应所需的基团需要发生反应外，其它基团都需要保护，否则会产生副产物。在固相合成第一步时，要脱去5’末端的DMT保护基，使5’末端的羟基暴露，以便进行下一步核苷的缩合反应。2、缩合反应当核苷脱保护后，5’末端的羟基与核苷的3’末端上的亚磷酰胺基团反应，脱去二异丙基胺。反应在供给体四氮唑的催化下，活化了磷酸酯键，使反就速度大大加快。3、戴帽在固相合成寡核苷酸时，载体上少部分5’末端核苷末起反应，使用乙酰氯试剂封闭，以减少核苷合成的错误。4、氧化反应为稳定3价磷的不稳定状态，氧化3价磷成为5价磷，使合成的磷酸二酯键不易因PH值的变化而断裂。氧化反应后，固相合成完成了接长一个核苷的循环，需进一步加长所需合成的反义核苷，进行上述四个步骤的循环，直到合成所需的长度。然后把寡核苷酸从载体上切割下来，得反义核苷粗产品。(二)本专利技术治疗癌症的混合反义药物的制备。分别取c-myc反义核苷、c-myb反义核苷和bcr-abl反义核苷各5毫克，混合均匀得本专利技术治疗癌症的混合反义药物。本专利技术治疗癌症的混合反义药物的实验结果分析(一)反义核苷对基因表达的抑制作用。选用人体慢性骨髓白血病细胞株(K562)作为受体，细胞生长在10％胎牛血清的RPMI-1640培养条件下，利用核酸杂交法(Northernblol)来鉴定c-myc反义核苷，c-myb反义核苷和bcr-abl反义核苷分别对受体细胞K562其基因c-myc,c-myb和bcr-abl的表达抑制，采用阳离子的脂质体(Lipofectin)作为反义核苷处理细胞的载体，脂质体(20μg/ml,Gibco公司)与10μM反义核苷以相同体积混合，二者均采用无血清培养基作为稀释液，反义核苷与脂质体的混合液在常温下放置10分钟后，加入培养的细胞中，细胞需经PBS清洗二次，然后加入反义核苷脂质体混合液，最终的反义核苷的浓度为250nM。对照采用培养基，正义核苷以及单独的运载体(脂质体)，2×166细胞经反义核苷分别处理后提取总的RNA(采用Trizol一步法，Gibco公司)。每个样品取20μg走电泳，然后经转移和32P探针杂交本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗癌症的混合反义药物，其特征在于它是由三种反义核苷等重量混合而成，三种反义核苷的ＤＮＡ序列分别是：ｃ－ｍｙｃ反义核苷：５’ＣＡＣ ＣＧＡ ＧＧＧ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＴ３；ｃ－ｍｙｂ反义核苷：５’ＡＧＧ ＴＡＧ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＧＧ ＡＣ３；ｂｃｒ－ａｂｌ反义核苷：５’ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＡＴ３。

【技术特征摘要】
1.一种治疗癌症的混合反义药物，其特征在于它是由三种反义核苷等重量混合而成，三种反义核苷的DNA序列分别是c-myc反义核苷5’CAC CGA GGG GTC GAT ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伯刚，
申请(专利权)人：中科院成都地奥制药公司，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]