用于由ＶＷＦ前肽制备成熟ＶＷＦ的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于由冯威勒布兰特因子前肽制备成熟冯威勒布兰特因子（ＶＷＦ）的方法，其包括如下步骤：－将ＶＷＦ前肽固定在离子交换树脂上；－用ｆｕｒｉｎ孵育固定化的ＶＷＦ前肽以获得固定化的成熟ＶＷＦ，以及－通过洗脱从离子交换树脂上分离成熟ＶＷＦ。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于由冯威勒布兰特因子(VWF)前肽制备成熟冯威勒布兰特因子的 方法。
技术介绍
在细胞内的蛋白质成熟过程中，待成熟的蛋白质经历翻译后修饰。这些修饰包括 乙酰化、甲基化、糖基化以及蛋白水解裂解。这些修饰在许多情况中对蛋白质功能及活性是 必需的，并且它们还会影响蛋白质尤其是酶的效力。前蛋白(或称蛋白质前体)是无活性的蛋白质，其通过这些翻译后修饰中的一个 以上、尤其通过来自前蛋白的前肽的裂解而转变为活性形式。前蛋白的例子包括，例如前体 胰岛素、凝血酶原等。活性化蛋白质的制备具有较高的临床和诊断价值。例如，活性化或熟化蛋白质可 用于控制凝血。活性蛋白质在活性有机体中的可用量通常很低。因此，它们的前蛋白和前体酶优 选通过与活化酶(例如蛋白酶)接触而在体外活性化。目前用于由前蛋白制备成熟蛋白质的方法要么使用固定化蛋白酶，要么在游离溶 液中进行。这两种方法均有缺点。其中，要求蛋白酶按如下工艺固定化。冯威勒布兰特因子(VWF)是一种在血浆中循环的糖蛋白，是大小为约500-20,000 kD的一系列多聚体。VWF的多聚体形式由通过二硫键连接在一起的250 kD多肽亚基构成。 VWF可调节初始血小板对受损血管壁的亚内皮的粘附性；人们认为仅仅较大的多聚体显示出 止血活性。具有大分子质量的多聚体被贮藏在内皮细胞的怀布尔—帕拉德(Weibel-Pallade) 体中，并在刺激时释放。然后，经释放的VWF会被血浆蛋白酶进一步处理，从而得到低分 子量形式的VWF。4 VWF由内皮细胞和巨核细胞合成，其作为预前肽VWF (pp-VWF')，较大程度 上由重复结构域构成。在信号肽裂解时，VWF前肽经由在其C端区的二硫键发生二聚体化。 该二聚体用作用于多体化的原聚体，这受控于在自由端末端之间的二硫键。在组合成多聚体 之后进行前肽的蛋白水解去除(Leyte等，Biochem. J.， 274 (1991) ， 257-261)。假定VWF前肽的生理学角色为在从VWF前肽分子中裂解之前或之后支配VWF 多聚体的组合(Takagi等，JBC 264 (18) (1989) ， 10425- 10430)。虽然在人体中前肽的 去除几乎是完全的，但在哺乳动物细胞系中的VWF的重组体高水平表达的情况中，该过程 不是很有效。来自这种基因工程细胞系的细胞孵育上清液通常包括成熟VWF和VWF前体比 如VWF前肽的混合物。因此，为获得成熟VWF，需要将VWF前体，特别是VWF前肽转变 成成熟VWF。例如，在EP 0 775 750A中，该熟化通过使用弗林蛋白酶(forin)来实现。特 别地，在EP 0 775 750 A中建议重组法共表达ftirin和VWF，使得VWF的熟化可原位发生。 在WO 00/49047中，描述了一种使用凝血酶制备成熟VWF的方法，其中熟化在溶液中或通 过使用结合在固体载体上的凝血酶进行。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于由VWF前肽制备成熟冯威勒布兰特因子(VWF)的有效方 法。本专利技术提供一种通过如下步骤制备成熟VWF的新颖方法将VWF前肽固定在离子交换 树脂上，接着用furin熟化被结合的VWF前肽，并从离子交换树脂上洗脱出经熟化的VWF。 本专利技术的方法特别适用于由VWF前肽在体外熟化VWF。该方法允许以较高的比活性和纯度 制备成熟VWF。本专利技术涉及一种用于由VWF前肽制备成熟VWF的方法，其包括如下步骤-将VWF前肽固定在离子交换树脂上，-用包含fUrin的溶液孵育该固定化的VWF前肽以获得固定化的成熟VWF，以及 -通过洗脱从离子交换树脂上分离成熟VWF。附图说明图1所示为furin活性对Ca^的依赖性。图2所示为熟化效力对VWF浓度的依赖性。5 ml溶于再增溶缓冲液(100 mM 梓檬酸，lOOmMHEPES， pH=7.0)的VWF试样掺入5单位forin/U VWF,并在37°C下孵 育22h。通过SDS-PAGE在8。/。凝胶上分析试样，并且通过银染色法显现分离的多肽。泳道h1 U/ml VWF + 5而fUrin，0h泳道2:5 U/ml VWF + 5 U/U forin，0h泳道3:10 U/ml VWF + 5 U/U ftirin，0h泳道4:1 U/ml V曹+ 5而fiirin，6h泳道5:5 U/ml VWF + 5而fiirin，6h泳道6:10 U/ml VWF + 5而fiirin，6h泳道7:1 U/ml VWF + 5 U/U fiirin，24 h泳道8:5 U/ml VWF + 5而fiirin，24 h泳道9:10 U/ml VWF + 5而fiirin，24 h。图3所示为熟化效力对VWF浓度的依赖性。5 ml溶于再增溶缓冲液(100 mM 柠檬酸，100mMHEPES， pH=7.0)的VWF试样掺入0.5 - 4.0单位fiirin/U VWF，并在37°C 下进行孵育。在TK)、 20以及24小时处抽取试样。通过SDS-PAGE在8。/。凝胶上分析试样， 并且通过银染色法显现分离的多肽。泳道l: VWF10U/ml泳道2: VWF + 0.5腦fiirin， Oh泳道3: VWF + 1 U/U fiirin， Oh泳道4: VWF + 2 U/U fiirin, Oh泳道5: VWF + 2.5 U/U fUrin， Oh泳道6: VWF + 4 U/U fbrin， Oh泳道7-ll:同上，20h泳道12-16:同上，24 h。图4所示为在柱上熟化后的TMAE洗脱液。经由包含VWF/VWF前肽的材料的 MAB液流在熟化之前以约180-220单位VWF Ag/ml树脂和VWF前肽/ VWF被泵抽到柱子上。1 CR29-E1 + E2 (2.4 U florin /U VWF;在37°C下3h; FUR24—04—UFK—02;梯度洗脱；2 CR30-E1 + E2( 3.2 U fiirin /U VWF;在37°C下lh; FUR—UF06—01 (克隆488-3);梯度洗脱3CR36-E， (7.8 U fiirin/U VWF;在4。C下4h; FUR—015 (在TMAE上预纯化)，分歩洗脱；4CR37-E， (5.8Ufiirin/UVWF;在4。C下8h; FUR—UF06—01 (克隆488-3)，分批洗脱；65 CR38-El+E2(4.8Ufurin/U VWF;在4。C下8h; FUR—018 (在TMAE上预纯化)；梯度洗脱。具体实施例方式本专利技术涉及一种用于由冯威勒布兰特因子前肽制备成熟冯威勒布兰特因子 (VWF)的方法，其包括如下步骤-将VWF前肽固定在离子交换树脂上，-用包含furin的溶液孵育该固定化的VWF前肽以获得固定化的成熟VWF，以及 -通过洗脱从离子交换树脂上分离成熟VWF。本专利技术的方法特别适用于由其VWF前肽在体外熟化VWF。目前制备成熟VWF 的传统方法包括通过用液相中的蛋白酶孵育其前肽形式从而使本身熟化(即来自前蛋白的前 肽的裂解)，以未结合态在游离溶液中发生；或者例如，如WO 00/49047中所述，通过将蛋 白酶固定在固体载体上从而与包含VWF前肽的制品接触并进行孵育(例如，参见WO 00/49047)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于由冯威勒布兰特因子前肽制备成熟冯威勒布兰特因子（ＶＷＦ）的方法，其包括如下步骤：　－将ＶＷＦ前肽固定在离子交换树脂上，　－用ｆｕｒｉｎ孵育固定化的ＶＷＦ前肽以获得固定化的成熟ＶＷＦ，以及　－通过洗脱从离子交换树脂上分离成熟ＶＷ Ｆ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-5-18 60/930,8911.一种用于由冯威勒布兰特因子前肽制备成熟冯威勒布兰特因子(VWF)的方法，其包括如下步骤-将VWF前肽固定在离子交换树脂上，-用furin孵育固定化的VWF前肽以获得固定化的成熟VWF，以及-通过洗脱从离子交换树脂上分离成熟VWF。2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述VWF前肽是重组体来源。3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述离子交换树脂包括三甲基氨基乙基基团 (TMAE)。4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述离子交换树脂被装入色谱柱中。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述VWF前肽被固定在所述离子交换树脂 上，并且在25°C处测定的电导率低于25 mS/cm下用forin孵育。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电导率低于20mS/cm。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电导率低于16mS/cm。8. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，在25°C处测定的电导率为至少40 mS/cm下， 从所述离子交换树脂中洗脱出所述VWF。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述电导率为至少60mS/cm。10. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述电导...

【专利技术属性】
技术研发人员：沃尔夫冈蒙特，阿图尔米特雷尔，迈因哈特哈斯拉赫尔，克丽斯塔迈尔，
申请(专利权)人：巴克斯特国际公司，巴克斯特保健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]