三疣梭子蟹抗菌肽基因及其克隆方法技术

三疣梭子蟹抗菌肽基因及其克隆方法，所说的三疣梭子蟹crustin抗菌肽 基因cDNA不包括polyA共有565nt，其中含有5’端非编码区(5’UTR)长75nt， 1个阅读框长330nt，3’非编码区(3’UTR)长160nt，其GenBank序列号为 FJ467931。本发明专利技术成功克隆到三疣梭子蟹I型crustin cDNA全长序列，可通过 基因工程方式构建原核或真核基因工程菌株，高效表达具生理活性的重组蛋 白，大量生产。作为饲料免疫添加剂可替代传统饲料中的某些抗生素，用于 海水养殖业，实现绿色养殖，减少乃至消除抗生素在水产品中的蓄积，提高 水产品质量；也可以作为某些耐药性抗生素的有效替代品，用于水产养殖业 中耐药性细菌的防治药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从三疣梭子蟹(尸om/w加'ft^e/aft^)中克隆的I型 Crustin抗菌肽基因，属生物

技术介绍
中国是全球最大的水产养殖大国，水产品总产量(捕捞+养殖)占全球35%， 其中水产品养殖产量约占全球的70%， 2005年水产品产量达5181万吨。其中海 水产品2854万吨，占总产量的55%，捕捞约1022万吨，人工养殖产品约1888 万吨。随着全球对水产品的消费逐年增加，国内消费增长势头迅猛，另一方面 全球海洋捕捞资源衰退，供给逐步转向以养殖水产品为主，中国水产养殖业在 全球消费中越来越重要。人工养殖比例逐年提高，1978年人工养殖比例占26%， 2005年人工养殖比例达61%。随着水产养殖业的蓬勃发展，由于高密度养殖、 养殖水域富营养化、生态环境恶化等原因使得水产养殖品种频频发生各种疾病， 经济损失严重，已成为21世纪水产养殖业发展的重要制约因素。据初步统计， 目前危害水产养殖生物的病害已达400 500种，大多数病害是由病毒、细菌、 真菌等微生物所引起的。而传统的抗微生物药物及饲料添加剂一一抗生素，由 于耐药性病原菌的形成，以及食品安全性等公共卫生上问题的提出，目前在世 界各国养殖业中的使用都受到严格限制，如欧盟自2006年1月1日起，全面禁 止食品动物使用抗生素促生长饲料添加剂，因此寻找安全的抗生素替代物、开 发安全高效的新型抗微生物免疫增强剂或能增强养殖品种机体免疫力的词料添 加剂成为研究的热点，也是我国养殖业、饲料行业健康、持续发展首要解决的 课题之一。近年来，随着对养殖动物的自身免疫机制的深入研究，发现动物体液中富含多种体液免疫因子如凝集素、防御素、抗菌肽及多种行使调控作用的蛋白因 子等。养殖品种自身来源的体液免疫因子由于其特殊的作用机制，不存在食品 安全问题与环境问题，并对养殖品种具有促生长、增强免疫力的功能，还可通 过基因工程技术大量发酵生产，不存在药源问题，成为替代传统抗生素作为绿 色饲料添加剂及抗感染药剂的理想选择，是当前饲料添加剂领域的研究热点。Crustins最早由Relf等在青蟹(C ra'm waewa^中分离鉴定，后续研究表明 Crustins普遍存在于甲壳类(蟹、对虾、龙虾、螯虾等)中，主要由甲壳类血淋 巴细胞合成，分子量7 14kDa，等电点pl7.0 8.7。甲壳类Crustins以其C末 端的WAP (whey acidic protein)结构域为标志，与甲壳类中发现的其它富含Cys 的抗菌肽区分开来，如同样富含Cys但不含WAP结构域的甲壳类抗菌肽 defensins、penaeidins等。WAP结构域是由8个保守的Cys位点形成四个二硫键， 构成一个紧密结构，这种结构又被称作4DSC结构(four-disulphide core)。含 有WAP结构域的蛋白广泛存在于其它生物类群中，如哺乳动物的 antileukoproteinases、 elafms、 trappins等，这些含WAP结构域蛋白一般都是小分子分泌蛋白，具有蛋白酶抑制剂、个体生长调节、组织分化调节等生理功能。 目前发现的Crustins均由信号肽和成熟肽两部分组成，信号肽区域长16 24 Aa， 与其它类型抗菌肽如cathelicidins、 defensins的保守性相比，Crustins信号肽保守 性较差，而成熟肽区域相对保守些。根据信号肽与成熟肽C末端之间结构的差 别，可将Crustins分为三个亚型I型信号肽与WAP之间存在一个序列长度多变、富含Cys的结构域，但 结构域中Cys的数量不超过6个，因此仅能形成一个4DSC类似结构域，而不 能形成完整的4DSC结构域，该区域的一致框架一般为一C—X(3)—C—X(8 一12)—C一C—X(16—17)—C一X(6)—C—X(9 —10)—。 I型Crustins主要存在于蟹、龙虫下和螯虾中。II型II型Crustins主要发现于对虾中，不仅有一个富含Cys结构域，而且 邻近信号肽区还有一个大约40 80 Aa的Gly富集区。Gly富集区在不同种中 Gly数量变化较大， 一般在20 50个之间，在对虾中一般以5 8个VGGGLG 重复结构出现，但在PeM^ 中发现的一个Type II crustin (EF523614)中，其Gly富集区的22个Gly残基不是以VGGGLG重复结构出现的。III型III型Crustins不仅缺乏II型的Gly富集区，而且也没有I型和II型 中的Cys富集区，因此某些文献中不把它归为Cmstins，而称之为SWD (single-whey domain)蛋白、chelonianin-like蛋白或antileukoproteinase-like蛋白。 有关III型Crustins目前研究的还较少，仅发现于户.Moo^tow，丄.Faam&， MarsMpeagwsy'a/ o/cjAS， Fe朋era/ eaews c/z/ms7's等对虫下中。用已报道的三种类型Crustins及其它一些非Crustins具WAP结构域蛋白构 建系统树显示:I型和II型各独立聚合为分枝，而III型Crustins与非甲壳类WAP 结构域蛋白，如人分泌型亮氨酸蛋白酶抑制剂(SLPI， X04502)、人抗白血球蛋 白酶抑制剂(ALPI， P03973)、鼠SLPI (AF151982)等聚为一枝。Crustins作为甲壳类直接抗菌防御因子的证据来源于研究Crustins在不同组 织中的表达以及实验感染研究。研究表明大多数Crustins在血淋巴细胞中是高水 平的组成型表达，在其它器官，如腮、心脏、肠也检测到编码Crustins转录体表 达，但这些器官中有丰富的血管分布，因此在这些器官中检测到Crustins转录体 是否是由于血淋巴干扰所造成的目前还不清楚；同时研究表明Crustins —般均有 较好的抗菌活性。例如Relf等报道C. mae加s Carcinin对龙虾致病菌A v/nVfara vr /7CW7、两株海洋菌尸/aococcws 5pp,禾口一株H盐菌M /w&w均具有抗菌活 性；Supungul P等(2008)报道重组尸.woodo Crustin (D766060)对5. awews 、S. //ae有很强的抑菌活性而对A vzW&m 、 M /wteus无效，但另一种重组P. woofifo Type II Crustins(EF654658)对G+菌和G-菌均有很强的抗菌活性，包括 A vzV7^ara var /zcww^z'以及另两禾中致病G'菌五.co// 363、 K /wrveyz'; Haug等(2006) 报道蜘蛛蟹K araweus Crustins对谷氣酸棒杆菌C g/wtomfc訓的半致死浓度仅为 3 mM; Zhang (2007)等报道中国对虫下F. c/^ew^重组crustins对S. aweus、 M /wfe船及三种Bacillus的半致死浓度也仅为2 8mM; Type III Crustins功能报 道较少，仅见AmparyupP等(2008)黑虎虾_P. moo^ w III型crust本文档来自技高网...

【技术保护点】
三疣梭子蟹的Ⅰ型ｃｒｕｓｔｉｎ抗菌肽基因，其特征在于，所说的三疣梭子蟹ｃｒｕｓｔｉｎ抗菌肽基因ｃＤＮＡ不包括ｐｏｌｙＡ共有５６５ｎｔ，其中含有５’端非编码区（５’ＵＴＲ）长７５ｎｔ，１个阅读框长３３０ｎｔ，３’非编码区（３’ＵＴＲ）长１６０ｎｔ，其ＧｅｎＢａｎｋ序列号为ＦＪ４６７９３１，全长ｃＤＮＡ序列如下：　１０　２０　３０　４０　５０６０　ｇａａａａｇａｇｃａ　ｇａａｃａａｇａｃａ　ｃｔｇｔｇｇｔｇｇａ　ｃａｃａｃｃｔｇｃｔ　ｃｔｃａｃｃａａｃｇ　ｔｃｔｔｃｃｔｃａａ　７０　８０　９０　１００　１１０　１２０　ｇａａｔｃｔａｔａｇ　ａｇａｔａａｔｇａａ　ｇａｔｇｃａｇａｃｔ　ｇｔａａｔａｇｃｃａ　ｔｇｇｃａｇｔｔｇｔ　ｇｇｃｔａｃｃａｔｔ　１３０　１４０１５０　１６０　１７０　１８０　ｇｔｇｇｃｃａｔｇａ　ｃａｇａａｇｃａｔｃ　ｃｃｔａｇｔａｃｔｔ　ｃｃａｔａｃｃｃａｇ　ｇｔｃｔｇｇａｔｔｇ　ｔａａｇｔａｃｔｇｇ　１９０　２００　２１０　２２０　２３０　２４０　ｔｇｃａａｇｇａｃａ　ａｃｔａｃｇａｔａａ　ａｃａｃｔａｃｔｇｃ　ｃｇｔｇｇｃｃｃａｃ　ｃａｇｇａｃｇｔａｃ　ｃｔａｔｃｃａｃｃｔ　２５０　２６０　２７０　２８０　２９０　３００　ｔａｔａｃｃｇａｇｃ　ｇｃｔｃｔｇｇｔａａ　ａｔｇｔｃｃｔｃｃｇ　ｇｔｃｃｇｔｇｃｔａ　ｃａｔｇｔａｃｔｇｇ　ｔｇｔｃａｇｇｔｃａ　３１０　３２０　３３０　３４０　３５０　３６０　ｃｇｃｃｔａｃｃａａ　ａｇｔｔｇｔｇｔｃｃ　ｃｃａｔｇａｔｇｇｔ　ｇｃｔｔｇｔｇａｃｔ　ｔｔｃｃａａｇｃａａ　ｇｔｇｃｔｇｔｔａｔ　３７０　３８０　３９０　４００　４１０　４２０　ｇａｃｇｃｃｔｇｔｇ　ｔｇｇａｇｃａｃｃａ　ｃｇｔａｔｇｃａａｇ　ａｃｔｃｃｔｇａｔｔ　ｔｃｔａｃａｃ　ａａｔｃａｔｔｇａａ　４３０　４４０　４５０　４６０　４７０　４８０　ｃｃａｇａｃｔｇａａ　ｇａｔｇａａａａｔｔ　ｔｔｔｃａｃｃａａｔ　ｔｔｔｇｃｔｔａｃａ　ａａｃｔｔｔａｃａｇ　ａｇａｔｇａｔａｔｔ４９０　５００　５１０　５２０　５３０　５４０　ｃｔｃｔｔａａａａｃ　ａｔｔｇａｔｔｔａｔ　ｇｇｔｔａｔｇｃｔａ　ｔｔｃｔａｔａｔｔｃ　ａｔｔｔｇｔａａａｃ　ａａｔａｔａａｃａａ　５５０　５６０　５７０　５８０　ａａｔａａｔａａａｃ　ｇｃａａｔｔｇｔａｔ　ｃｃｇｔｇａａａａａ　ａａａａａａａａａａ。...

【技术特征摘要】
1. 三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因，其特征在于，所说的三疣梭子蟹crustin抗菌肽基因cDNA不包括polyA共有565nt，其中含有5’端非编码区(5’UTR)长75nt，1个阅读框长330nt，3’非编码区(3’UTR)长160nt，其GenBank序列号为FJ467931，全长cDNA序列如下10 20 30 40 5060gaaaagagca gaacaagaca ctgtggtgga cacacctgct ctcaccaacgtcttcctcaa70 80 90100110120gaatctatag agata<u>atg</u>aa gatgcagact gtaatagcca tggcagttgtggctaccatt 130140150 160 170180gtggccatga cagaagcatc cctagtactt ccatacccag gtctggattgtaagtactgg 190200210220230240tgcaaggaca actacgataa acactactgc cgtggcccac caggacgtacctatccacct 250260270 280 290300tataccgagc gctctggtaa atgtcctccg gtccgtgcta catgtactggtgtcaggtca 310320330340350360cgcctaccaa agttgtgtcc ccatgatggt gcttgtgact ttccaagcaagtgctgttat 370380390400 410420gacgcctgtg tggagcacca cgtatgcaag actcctgatt tctacacaatcattgaa 430440450460470480ccagactgaa gatgaaaatt tttcaccaat tttgcttaca aactttacagagatgatatt 490500510520530540ctcttaaaac attgatttat ggttatgcta ttctatattc atttgtaaacaatataacaa 550560570580aat<u>aataaa</u>c gcaattgtat ccgtgaaaaa aaaaaaaaaa2.如权利要求1所述的三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因，其特征在于，所说的三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽cDNA推导编码氨基酸序列如下<formula>formula see original document page 3</formula>CPHDGACDFP SKCCYDACVE HHVCKTPDFY * 。 ------3.如权利要求1所述的三疣梭子蟹的I型cmstin抗菌肽基因，其特征在于，所说的三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽cDNA读码框及推导蛋白质氨基酸序列如下gaaaagagca gaacaagaca ctgtggtgga cacacctgct ctcaccaacg tcttcctcaa 60gaatctatag agata atg朋g atg cag act gta ata gcc atg gca gtt gtg Met Lys Met Gin Thr Val lie Ala Met Ala Val Val get acc att gtg gcc atg aca gaa gca tec eta gta ctt cca tac cca 159 Ala Thr lie Val Ala Met Thr Glu Ala Ser Leu Val Leu Pro Tyr Pro 28ggt ctg gat tgt aag tac...

【专利技术属性】
技术研发人员：申望，王日昕，石戈，廖智，王建鑫，
申请(专利权)人：申望，王日昕，石戈，廖智，王建鑫，
类型：发明
国别省市：33