本发明专利技术涉及一种ＨＣＶ病毒抗原及配体ＰＣＲ管式检测试剂盒，该试剂盒包括包被捕捉获得性人类免疫缺陷病ＨＣＶ病毒靶分子的抗体或配基的ＰＣＲ管、用于获得性人类免疫缺陷病ＨＣＶ病毒配体／抗原检测的检测试剂Ａ液和Ｂ液、标准品和对照品。本发明专利技术通过特异寡核苷酸配基（或携带信号分子的特异寡核苷酸配基）与配体直接结合，将配体信号转换成核酸配基信号，然后经ＰＣＲ扩增放大、检测，来测定配体，因此其检测配体具有快速、灵敏度高、可定量检测的特点。同时本发明专利技术还公开了该试剂盒的制备方法和在检测获得性人类免疫缺陷病ＨＣＶ病毒的特异寡核苷酸配体中的应用方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种HCV病毒抗原及配体管式 PCR检测试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
早期蛋白质检测是以抗体同特定待检物蛋白质的低解离常数和一定的特 异性为基础，采用简易方便的筛选方法——抗体捕捉法。该法是检测样品中 有无抗原首先将抗原包被于固相支持物，然后用抗体去结合抗原形成复合 物，冲洗去掉未结合的抗体，最后用和结合抗体特异识别的标记分子去检测 结合抗体；也可以抗原、抗体先反应形成复合物后，再结合到固相支持物上， 然后检测复合物。许多抗体捕捉法是利用间接法来检测抗体，如检测抗体是 鼠抗体，则检测分子可能是带检测标记的兔抗鼠抗体，所用的传统检测标记 包括放射性同位素、染料和作用于底物产生可检测分子如色原的酶。酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是广为 人知的免疫检测法，传统的ELISA技术似三明治夹心法，即两抗体共同结合 到某一抗原——捕捉抗体，将其同样品中的抗原结合，再加入同抗原结合的 偶连酶的检测抗体，然后反应形成捕捉抗体一抗原一检测抗体三明治复 合物，最后测偶连酶活性显示检测结果。虽然抗体检测法具有较大的应用价 值，但是它的检测范围受捕捉抗体和抗原反应的解离常数(Kd)值限制。在 实践中，检测低限大约是Kd值的1。/。，当待分析物浓度降低到这个可能检测 极限时，所捕捉到的待分析物抗体百分率将不足以产生相对于信噪比的可检 测信号。因此，用荧光或化学发光检测系的抗体检测法的检测下限约lpg/ml (10-4M对平均分子量50， OOO道尔顿的蛋白质)。随着基因技术应用的快速发展，在抗原抗体检测方面已有较多的基因检 测技术。核酸待测物的检测要求不同于抗体检测的技术。在二十世纪八十年代中 期，DNA技术的研究发现了通过酶重复扩增过程可扩增DNA的方法，后来 叫聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ， PCR):首先加入两互补的寡核5苷酸序列(叫引物)，它将结合在所要扩增的区域的两侧，然后加热变性，在降温退火过程中让引物同互补序列结合，再加入Klenow片段DNA聚合酶I 以延伸引物，通过重复变性、退火、延伸所希望的片段，目标DNA就会以指 数方式扩增。PCR曾经过许多改进， 一个重要的变化是耐热聚合酶(即Taq 聚合酶)的应用，它产于温泉中嗜热菌，具有热稳定性，几乎不被PCR变性 中高温影响，所以不必像应用不耐热的Klenow聚合酶I ，每一次变性后得补 加聚合酶。在以PCR作为扩增系统的运用中，产生了免疫-PCR方法。该法是把特 定待测物连接到微孔板上，然后用PCR扩增放大能力来检测一例如小牛血 清白蛋白(BSA)被动吸附到一免疫检测板上，加入对BSA的特异抗体(连 有蛋白A链亲和素融合蛋白及生物素标记的报告扩增子)，PCR后用琼脂糖 电泳分析报告扩增子，可检测到几百个BSA分子，但这种方法不能实现定量 检测，同时因为缺乏待测物的特异捕捉分子，也不能用于生物样品检测。为 此，人们不断对其进行改进首先用生物素化第二抗体和一个连接生物素化 报告扩增子的链亲和素融合蛋白，然而5种试剂的加入、洗板、扩增、检测 很费时费力，而且解离复杂；随后又把报告扩增子共价连到第二抗体上，虽 然直接连接减少了试剂数目和解离复杂性，但仍需要PCR操作，劳动强度和 试验室污染的可能性还是无法降低。三明治式免疫-PCR是由传统ELISA方式的改编而来，即检测抗体连有 DNA标记，再运用到分析检测生物样品。早期的抗体免疫-PCR检测形式是 将初级抗体固定在平板上，然后依次加入样品，再用生物素化检测抗体，链 亲和素和生物素化的DNA;后来改进为直接连接DNA到抗体上和用标记引 物产生PCR产物，而PCR的扩增能力可产生大量DNA标记，这种DNA标 记可用典型的凝胶电泳检测分析。PCR扩增抗体携带的DNA标记可提高对 抗原检测的灵敏度(该法缺少用基因芯片法来检测)，比传统ELISA方法的 灵敏度还高，但用凝胶电泳纯化扩增产物需要大量人工操作，因此耗时；而 且用于PCR扩增的引物在退火时可引起二聚体扩增产生副产品；同时它还存 在污染核糖或污染也将同样被扩增的情况。免疫PCR方法是采用一个捕捉抗体，类似于直接ELISA三明治夹心法， 不同点在于选择检测方法。该方法已被成功用于检测肿瘤坏死因子、3-半乳 糖甘酶、人甲状腺刺激激素、鼠可溶T-细胞受体、重组乙肝表面抗原、不同的人心钠素、e-葡糖苷激酶、绒毛膜促性腺激素等物质，有的敏感度达io5 摩尔水平。在免疫PCR方法中，抗原浓度通常由PCR后产物分析决定，可以是凝 胶电泳分析，也可以是PCR-ELISA分析。定量分析PCR终点产物的DNA标 记易产生错误结果，因为产物形成率在几个对数增长循环后即下降，再者PCR 样品处理可导致实验室污染；另外，这些实验由于步骤多且需冲洗，因此在 这个过程中抗原抗体复合物可能会出现解离。实时定量PCR是更先进的PCR技术，已用于核酸分析。在实时PCR中， PCR扩增DNA是在非线性标记、双荧光杂交探针存在条件下进行，其中一 种荧光染料用作报告分子，它的发射光谱被第二种荧光染料淬灭;该实时PCR 在链延伸时，报告染料位于杂交探针5'端(FAM)，淬灭染料位于3'端 (TAMRA)，此探针和PCR扩增的特殊耙序列结合，当未结合时，5'端FAM 发射的荧光被3' TAMRA淬灭，但随着PCR循环增加，扩增子增多，杂交 探针被Taq多聚酶5' -3'核酸活性切割，结果使报告荧光染料从淬灭染料 中释放出来，致报告分子发射峰值增加。序列检测系统用氩原子激光激活荧 光(488nm)，激光装置照相机监控PCR反应，收集从所有96孔发出的 500nm-660nm荧光，然后利用相应原理、设立内参照，直接通过一定的软件 分析定量。该技术实现整个反应实时监控，同时也可应用逆转录-PCR。由 于序列检测系统用96孔热循环仪可连续检测每孔中PCR反应时的荧光谱， 因此，可排除复制子试验室污染。Gold等在1995年(GoldL， et al.Amu Rev Biochem (生物化学年报)， 64:763-797)应用SELEX筛选出的系统性红斑狼疮特异抗体的RNA和 ssDNA配基，不仅对系统性红斑狼疮进行诊断，而且可以进行病情监测和疗 效检验；Gold等又在1999年(GoldL， etal.Diagn Dec (诊断)；4(4):381陽8) 在配基微阵分子诊断应用研究中，对配基微阵分辨率进行了研究。上述研究 均显示出核酸配基检测具有巨大的应用前景，但是目前的配基检测都是采用 直接对配基PCR扩增放大检测，这种检测操作复杂，不但需要将配体和配基 分离，而且由于配体和配基分离后，配基纯度及残留配体和配基的再结合可 以阻断DNA复制，因此导致检测灵敏度低和准确性差。核酸与蛋白质在细胞内相互作用是普遍现象，核酸能折叠形成二级结构 和三级结构，这对其与蛋白质相互结合作用非常重要，通过使核苷酸序列多样化而使体外检测核酸蛋白质相互作用方法成熟。指数富集的配基系统进化技术(Systematic EvolutionofLigandsby Exponentia本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＨＣＶ病毒抗原及配体管式ＰＣＲ检测试剂盒，包括 －ＰＣＲ管为聚苯乙烯材料制成的普通ＰＣＲ管，其上包被捕捉获得性人类免疫缺陷病ＨＣＶ病毒靶分子的抗体或配基； －检测试剂Ａ液和Ｂ液，用于获得性人类免疫缺陷病ＨＣＶ病毒配体／抗原检 测； －标准检测样品； －阴性和阳性对照样品。
【技术特征摘要】
1、一种HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒，包括—PCR管为聚苯乙烯材料制成的普通PCR管，其上包被捕捉获得性人类免疫缺陷病HCV病毒靶分子的抗体或配基；—检测试剂A液和B液，用于获得性人类免疫缺陷病HCV病毒配体/抗原检测；—标准检测样品；—阴性和阳性对照样品。2、 一种用于如权利要求1所述的HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试 剂盒的A液，其特征在于它由100 ul、 pH值为7.4的25pmol/ul带有人为 序列修饰的检测配基和2ug/ml抗体的磷酸盐缓冲液组成。3、 如权利要求2所述的一种用于HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试 剂盒的A液，其特征在于所述人为序列修饰的检测配基是指人为在配基的 3'和5，端分别或同时加上已知序列的单链茎环结构和两条互补双链。4、 一种用于如权利要求1所述的HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试 剂盒的B液，其特征在于它由lul上游引物、lul下游引物、8ul4XdNTP、 10 ul IOXPCR缓冲液、2-5单位的耐热DNA聚合酶和水组成；其中上游引 物序列为1: 5， -TCTAACGTGAATGATAG-3';下游引物序列为2: 5， -TATGGTCGAATAAGTTAA-3 ，。5、 如权利要求4所述的一种用于HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试 剂盒的B液，其特征在于该B液还含有分子信标。6、 如权利要求5所述的一种用于HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试 剂盒的B液，其特征在于:所述的分子信标是修饰序列的茎环分子信标、SYBR Green 1荧光染料及带有荧光分子和淬灭分子的探针分子信标中的任意一种。7、 一种制备如权利要求1所述的HCV病毒抗原及配体管式PCR检测试 剂盒的方法，包括以下步骤(1) 在37土rC下、用体积浓度为1 20。/。的戊二醛处理PCR管，使戊二醛 附着在PCR管；(2) 用超纯水清洗PCR管；(3) 将捕捉HCV靶分子的配基/抗体包被在PCR管上；(4) 用pH值为7.4的含5%的脱脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龟精DNA 的碳酸氢钠缓冲液封闭PCR管，经干燥...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖世奇，
申请(专利权)人：兰州普利生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]
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