一种刺参用复合免疫增强剂制造技术

一种刺参用复合免疫增强剂，其特征是由β－葡聚糖和甘露寡糖所组成，β－葡聚糖的重量百分数范围分别为５５－６５。本发明专利技术作为免疫增强剂在刺参饲料中使用，添加量仅为０．２－０．３％（质量百分浓度）就能明显促进刺参的生长，显著提高刺参的免疫力和抗病力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可用于剌参饲料的添加剂，特别涉及一种剌参用的复合免疫增强剂。
技术介绍
剌参(A卯stichopus j即onicus)具有很高的食用价值和药用价值，是中国传统的 名贵海产品，自古以来就被誉为"海产八珍"之一。近年来，中国北方大力发展剌参养殖业， 剌参已成为海水养殖业中产值较大的养殖品种之一。然而，规模集约化养殖和不规范的操 作所造成的剌参病害问题日趋突出，出现了多种明显病症和大规模死亡现象，严重影响了 该行业的可持续发展。 免疫增强剂是指具有促进或诱发宿主防御反应，增强生物机体抗病能力的一类物 质，主要作用于水生无脊椎动物的非特异性免疫机制，激活机体自身的免疫机能从而达到 防御效果，增强其抗病力。免疫增强剂与抗生素和疫苗相比，具有安全、无残留、作用范围 广和使用方便等优点，其在水产养殖中的应用发展迅速，种类逐渐增多，在水产养殖中研究 和使用的免疫增强剂达数十种。目前所使用的免疫增强剂一般都是单一成分，事实已经证 明单一免疫剌激成分无法维持长期高效的免疫增强效果，且易引起养殖动物的免疫疲劳现 象，因此需要进行复合免疫增强剂的配伍和优化，开发出高效的免疫增强剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种剌参用复合免疫增强剂，它能弥补现有单一成分免疫增 强剂的上述不足。 —种剌参用复合免疫增强剂，其特征是由13 -葡聚糖和甘露寡糖所组成，|3 _葡聚 糖的质量百分数范围为55-65。 本专利技术作为免疫增强剂在剌参饲料中使用，添加量仅为0. 2-0. 3% (质量百分浓 度，下同)就明显促进剌参的生长，显著提高剌参的免疫力和抗病力。具体实施例方式—.实验饲料的制作 首先分别称取|3 _葡聚糖600g，甘露寡糖400g，将这两种成分混合均匀(要求变异系数《5% )，即为本专利技术的一种剌参用复合免疫增强剂。然后以鼠尾藻粉、鱼粉、面粉、豆粕、鱼油、卵磷脂、复合维生素、复合矿物盐和磷酸二氢钙为原料，配制2种剌参人工配合饲料(详见表l) :1#饲料为不添加免疫增强剂的对照组；2#饲料为添加了剌参用复合免疫增强剂的处理组。 表1 :试验饲料配方原料名称饲料1# (%)饲料2# (%)鼠尾藻粉50. 0050. 00鱼粉8. 008.00豆粕13.0013.00鱼油1.001.00卵磷脂1. 001. 00复合维生素0. 500. 50复合矿物盐1.001.00磷酸二氢钙1.001.00面粉24. 5024. 25本专利技术刺参用复合免疫增强剂00. 25 二.剌参的饲养与管理 选用当年人工孵化的同一批剌参，体重约4g，作为试验用剌参。经2周的驯养后， 挑选出体格健壮、规格一致的剌参进行分组试验。共分为2组，每组设3个平行，每个平行为 1个150L的玻璃钢桶，放养30头试验用剌参，2个组分别投喂1#和2#试验饲料。每天换水 一次，换水量为总体积的3/4，充气。在为期4周的养殖试验中，海水的溶解氧在7. 8-8. 2mg/ L， pH 7. 5-8.0，盐度30-32，温度13-15°C。每天在晚18:00投喂一次，饱食投喂，每日清除 残饵及排泄物。 三.剌参样品的采集、分析与计算 1.生长指标的测定 试验开始和结束时，对每个平行的剌参进行计数、称重，计算剌参的特定生长率和成活率。计算方法如下 存活率=Nt/N。X100 特定生长率=(LnWt_LnW。) X100/t 其中，N。和Nt分别为每个平行剌参初始头数和终末头数，W。和Wt分别为每个平行 剌参初始体重和终末体重，t为实验天数。 2.免疫指标的测定 试验结束后，首先解剖获取剌参体腔液，将剌参体腔液与剌参抗凝剂(0. 02MEGTA，O. 48MNaC1，0. 019M KC1，0. 068M Tris-HCl，pH 7.6)按照体积比1 : 1混匀。然后取一部分抗凝体腔液直接用于体腔细胞计数、吞噬率以及超氧阴离子含量的测定；另一部分抗凝体腔液经离心，弃去上清液后，加入冰冷的PBS缓冲液重悬细胞，体腔细胞悬液经超声波破碎后，再离心，所得上清液即为细胞破碎上清液，该上清液用于超氧化物歧化酶和一氧化氮合酶的测定。 (l)体腔细胞计数 取100 i！ L抗凝体腔液，以血球计数板在光学显微镜下进行计数，计算出体腔细胞 密度。(2)吞噬率的测定 将1000 ii 1抗凝体腔液加入到48孔板中，加入50 y 1异硫氢酸荧光素(FITC)标 记的金黄色葡萄球菌(菌液密度为109)，混匀后，181:下避光反应1小时，加入500111冰冷 的L-15细胞培养液，终止反应，并加入80iU的台盼蓝(0.4%溶于磷酸缓冲液)猝灭未吞噬的金黄色葡萄球菌，用流式细胞仪进行检测。吞噬率的计算公式为细胞吞噬率(％ )=发生吞噬的细胞数/细胞总数X 100。 (3)超氧阴离子含量的测定 在96孔板中先加入50ii L抗凝体腔液，离心，去除上清液，然后每个孔加入200ii1的O. 2%的四唑氮蓝(NBT)溶液，18t:下反应30min。离心去掉上清液，向每个孔加入200ii1100% (体积百分浓度)甲醇，固定10min，再以70% (体积百分浓度)的甲醇水溶液洗2次，将96孔板自然风干。风干后，每孔加入120 ill 2mo1/1的KOH水溶液和140 yl的二甲基亚砜(DMSO)，沉淀溶解后，于室温下用酶标仪在630nm波长下读取吸光值。 (4)超氧化物歧化酶(SOD)活力和一氧化氮合酶(NOS)活力的测定超氧化物歧化酶(SOD)活力和一氧化氮合酶(NOS)活力的测定均采用试剂盒(购买自南京建成生物工程研究所)进行测定。 3.抗病力的测定 检测剌参抗病力所用的菌株为剌参"腐皮综合征"致病菌-灿烂弧菌，细菌用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)在2『C下培养24h，然后用无菌生理盐水冲洗菌落，并调整浓度至1 X 109CFU/ml。每头剌参经体腔注射100 ii L菌液。观察2周后，计算剌参的累计发病率(累计发病率=发病的剌参数/剌参总数X 100)。 最后采用SPSS 13.0 for Windows对上述指标测定数据进行单因素方差分析。实验结果用平均值±标准误(mean士S. E.)表示。具体实验结果见表2。 试验结果表明在剌参饲料中添加本专利技术的剌参用复合免疫增强剂，能够显著提高剌参的特定生长率、体腔细胞数、吞噬率、超氧阴离子含量、超氧化物歧化酶活力和一氧化氮合酶活力，并显著降低剌参的累积发病率。由此可见，极少量的剌参用复合免疫增强剂就能够显著提高剌参的生长、免疫力和抗病力，作为剌参长期高效的免疫增强剂是完全可行的。 表2 :投喂剌参用复合免疫增强剂对剌参存活、生长、免疫力和抗病力的影响对照组处理组存活率(％)100100特定生长率(％/天)2. 00 ±0.014. 20 ±0. 03体腔细胞数(106)13. 80±0. 3818. 17±0. 52吞噬率(％)12. 67±0. 2619. 20±0. 26超氧阴离子(O.D. 630nm)0. 36±0. 010. 53±0. 01超氧化物歧化酶(U/ml)54. 34±1. 1276. ll土l.OO一氧化氮合酶(U/ml)1. 17±0. 031.92±0. 04累积发病率(％)55. 0±2. 918.3±1. 权本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种刺参用复合免疫增强剂，其特征是由β－葡聚糖和甘露寡糖所组成，β－葡聚糖的质量百分数范围为５５－６５。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谷珉，麦康森，马洪明，张文兵，王小洁，艾庆辉，徐玮，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]