一种检测肠病毒的快速检测试纸及其制造方法技术

本发明专利技术公开了一种检测肠病毒的快速检测试纸及其制造方法。其通过颜色颗粒标记的免疫层析法检测样本中的肠病毒ＥＶ７１和Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６病毒。本发明专利技术的快速检测试纸条是在底板上顺次相互搭接的粘贴样品吸液层、颜色颗粒储藏垫、硝酸纤维素膜和吸水板而形成的检测试纸条。其中颜色颗粒储藏垫上涂覆有颜色颗粒标记的单克隆抗体，硝酸纤维素膜上设有ＥＶ７１和／或Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６单克隆抗体喷涂的试验线和抗鼠ＩｇＧ多克隆抗体喷涂的控制线。本发明专利技术能够分别或同时检测样本中的ＥＶ７１和Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６病毒，能够尽早发现由这些病毒感染所引起的疫情，并且具有操作简便、快速获得结果、无需专业人员操作等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测肠病毒的快速检测试纸以及其制造方法，尤其是检测可导致手足口病的肠病毒EV71和Coxsackievirus A16病毒的快速检测试纸。
技术介绍
手足口病(Hand foot mouth disease, HFMD)是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报导，是由肠病毒引起的传染病，多发生于5岁以下的婴幼儿，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中柯萨奇病毒(CoxAsckievirus)A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(Enterovirus71.EV71)最常见。澳大利亚和美国、瑞典一样，是最早出现EV71感染的国家之一。1972 1973年、1986年和1999年澳大利亚均发生过EV71流行，重症病人大多伴有中枢神经系统症状(CNS)， 一些病人还有严重的呼吸系统症状。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以CNS为主要临床特征的EV71流行，仅保加利亚就超过750例发病，149人致瘫，44人死亡。英国1994年4季度暴发了一起遍布英格兰威尔士由CoxA16引起的手足口病流行，监测哨点共观察到952个病例，为该国有记录以来的最大一次流行，患者大多1 4岁，大部分病人症状平和。该国1963年以来的流行病资料数据显示，手足口病流行的间隔期为2 3年。其它国家如意大利、法国、荷兰、西班牙、罗马尼亚、巴西、加拿大、德国也经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV71引起的手足口病。日本是手足口病发病较多的国家，历史上有过多次大规模流行，1969 1970年的流行以CoxA16感染为主，1973和1978年的2次流行均为EV71引起，主要临床症状为手足口病，病情一般较温和，但同时也观察到伴无菌性脑膜炎的病例。1997 2000年手足口病在闩本再度活跃，EV71、 CoxA16均有分离，EV71毒株的基因型也与以往不同。20世纪90年代后期，EV71开始肆虐东亚地区。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4 8月共有2628例发病，仅4 6月就有29例病人死亡。死者平均年龄1.5岁，病程仅2天，100%发热，62%手足皮疹，66%口腔溃疡，28%病症发展迅速，17%肢软瘫，17例胸片显示肺水肿。年3月份以来，我国安徽省阜阳市也发生了较大规模的手足口病疫情。截至5月1日，安徽阜阳累计报告手足口病3321例，其中22例死亡；有978例正在住院治疗，其中重症病例48人，病危10例；正在接受门诊治疗1209人；已治愈1112人。EV71感染引起重症的比例高于其他类型肠道病毒，重症患儿病死率较高，目前尚无疫苗和特效治疗药物。因此，能够及时检测出患者体内携带的EV71病毒和CoxA16病毒，有助于及早发现并控制疫情，对患者及早治疗，挽救生命。目前，检测肠道病毒，国内外多采用病毒分离、免疫荧光法、PCR等检测手段。病毒分离法耗时太长且成本较高；免疫荧光法需要昂贵的荧光显微镜且标本不易保存；PCR方法不3能区别有感染毒力的病毒和死病毒，同时上述方法均需专业人员操作。正是因为现有检测方法的落后，因此开发出使用方便，检测灵敏，价格低廉的检测产品是当务之急。颜色颗粒免疫层析分析为肠病毒的检测提供了一个新的检测途径。免疫微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体，包被上具有特异性亲和力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，用于免疫学及其他生物学检测与分离的一项技术。作为载体的微粒通常是以某种高分子有机单体为原料，经过乳液聚合、悬浮聚合及辐照聚合等高分子聚合方法制备而成。由于制备材料及工艺不同，微粒的种类繁多，现已制成惰性微粒如聚苯乙烯胶乳微粒、活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及标记微粒(用同位素、荧光素或酶标记)等四大类微粒，数量多达几十种。将制备好的微粒与抗原(或抗体)经物理吸附、化学偶联及生物素亲合素桥联法等致敏方法形成免疫微粒。广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、分离与纯化、细胞标记与识别等。近年来，微粒技术在核酸分子杂交、DNA与RNA的分离及PCR等研究领域亦显示出广阔的应用前景。乳胶微粒作为免疫微粒的一种，采用合成高分子乳胶微球，即羧化的聚苯乙烯乳胶作为载体，将抗体或抗原通过物理吸附固载于微球表面而形成免疫乳胶诊断试剂，通过胶乳凝集实验可检测对应的抗原或抗体。制备成的乳胶诊断试剂，用于诊断多种疾病，具有简便、快速、灵敏、价廉及操作容易等优点。胶体金免疫层析技术是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、免疫层析技术及胶体金显色技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，是根据免疫反应原理，利用大孔径微孔滤膜为载体，以胶体金作为固相标记物来检测样本中待测物质的一种快速免疫分析技术。本专利技术在颜色颗粒免疫层析技术原理基础上，改进检测方法，建立了采用胶体金法及乳胶法检测肠病毒的方法。检测方法的改进，使检测更方便，结果更准确，具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员操作等特点，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一。
技术实现思路
本专利技术为解决上述现有技术中存在的问题，提供了一种采用颜色颗粒免疫层析法来检测EV71和Cox A16病毒的快速检测试纸。其使用方便、结果准确、成本低、运输储存简便，且无需专业人员操作。本专利技术还提供了制备这种试纸的方法。为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的一种检测EV71和Cox A16病毒快速检测试纸，由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、病毒颜色颗粒储藏垫、样品吸液层组成；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条或两条检测线和一条多克隆抗体控制线，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和病毒颜色颗粒储藏垫相互交叠连接，在病毒颜色颗粒储藏垫上压有样品吸液层，利用颜色颗粒免疫层析法来检测病毒。上述病毒单克隆抗体可以是EV71病毒单克隆抗体和/或Cox A16病毒单克隆抗体，也可以是二者的混合。颜色颗粒可以是一种金属溶胶颗粒，可包括胶体金颗粒、银颗粒、铁颗粒、磁性颗粒等；一种标记颗粒，可包括染料颗粒、乳胶颗粒、荧光颗粒等。其中，胶体金颗粒的颗粒直径大小为纳米级，乳胶颗粒直径大小0.01 10ura;金属溶胶颗粒的吸附机理是利用它在碱性条件下带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团，靠静电吸引而结合；乳胶颗粒是利用化学结合的方式与蛋白质分子结合，形成免疫诊断试剂。样品吸液层由三层材料叠加组成，依次为10 25g/n^无纺布层、玻璃纤维层、10 25g/m2无纺布层，上述物质均需经过表面活性剂缓冲液浸泡处理，干燥后备用，上述装置除有毛细管作用原理外，还有虹吸作用原理，大大加快吸水移动速度。用灭活的EV71病毒或CoxA16病毒免疫小鼠，细胞株注射鼠腹腔，提取腹水迷行纯化，在筛选出的杂交瘤细胞株中，分别获得2株高纯度、配对的EV71病毒单克隆抗体细胞株和CoxA16病毒单克隆抗体细胞株， 一株用于检测线包被， 一株可用于颜色颗粒标记。把试纸样品吸液层放入待测样本中(液面不得超过MAX线)，由于毛细管作用样品将沿着试纸条向吸水板移动，当移动至颜色颗粒储藏垫时，样品中的EV71病毒和/或Co本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测肠病毒的快速检测试纸，其包含背板、吸水板、样品吸液层、硝酸纤维素膜、颜色颗粒储藏垫，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上设有至少一条单克隆抗体检测线和多克隆抗体控制线，颜色颗粒储藏垫中含有单克隆抗体包附的颜色颗粒；上述单克隆抗体选自下列中的至少一种：　肠道病毒ＥＶ７１小鼠单克隆抗体；　科萨奇病毒Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６小鼠单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万志静，万志强，
申请(专利权)人：万志静，万志强，
类型：发明
国别省市：11[]