表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球，所修饰的阳离子所带电荷数目可随溶液ｐＨ变化而相应改变。采用溶胶凝胶法，在四氧化三铁纳米粒子存在的情况下，水解正硅酸乙酯形成磁性二氧化硅微球。以环氧硅烷化试剂３－缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷（ＧＰＴＭＳ）活化二氧化硅磁性微粒，选择ｐＫａ值介于４～８的阳离子修饰剂作为功能基团，通过共价作用将其制备成表面修饰有阳离子的磁性二氧化硅微球。该方法包括制备磁性二氧化硅微球、磁性二氧化硅微球的环氧基化和磁性二氧化硅微球表面阳离子修饰。以该方法制备出的磁性微球可依据表面电荷的变化用于从生物样品中分离核酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于材料合成领域，涉及一种用于生物样品中分离核酸的材料的制备方法，具体涉及一种。
技术介绍
生物磁分离技术是在传统磁分离技术的基础上发展起来，以细胞、细菌、核酸和蛋 白质等生物体为应用对象的高效分离技术。它利用磁性或磁性标记生物体在外磁场作用下 做定向运动这一特性，对目标生物体进行提取、富集、分离和纯化。早期的工作主要集中于 发展磁性标记物的制备技术上，包括通过在磁流体中浸渍将磁性纳米粒子吸附到琼脂糖、 聚丙烯酰胺、聚戊二醛和聚乙烯醛等聚合物微球中。这种微球以颗粒大小分布均匀和磁性 粒子含量均匀为特征，保证了不同生物分离过程的可重现性和可控性。生物磁分离技术与 标准分离步骤相比有一定优势。首先磁分离过程通常非常简单，只涉及几个处理步骤，所有 的纯化步骤都可在单个试管或者容器中发生，不需要昂贵的液相色谱系统、离心机、过滤器 或者其它设备。分离过程可以在含有悬浮固体物质的粗制样品上直接进行。在某些情况下， 例如细胞内蛋白质的提取，甚至可以整合裂解和分离步骤，从而縮短整个分离时间。磁分离 技术对细胞、蛋白质和核酸等生物体通常是非常温和的。与高速离心和亲和色谱相比，磁分 离技术具有较低的剪切力，能较好地保持被分离细胞的活力和生物分子的生物活性。 目前，生物磁分离技术正在成为生命科学研究的一个重要手段。在分子生物学领 域中，核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。作为遗传信息的携带者，DNA是基因表 达的物质基础，除在生物体正常生长、发育和繁殖等生命活动中的作用外，它与生命异常如 肿瘤的发生、遗传疾病等也密切相关。因此，对核酸分离纯化是许多研究领域的重要前提和 保障。 目前常见的核酸分离方法有酚提取/沉淀法、层析法、密度梯度离心法等。这些传 统方法往往比较费时，步骤繁琐，需使用有机试剂，有损操作者健康。所以有必要研究一种 新的快速、方便的提取基因组DNA的方法。 Levison应用一种以磁性琼脂糖微球作为基质，表面修饰二乙胺基乙基(DEAE)的 磁性微球用于核酸提取。 孙敏莉通过磁性纳米粒子与葡聚糖-DEAE包裹的方法合成一种磁性葡聚糖-DEAE 微球，并应用于大场杆菌中提取质粒。 上述两种表面修饰DEAE的磁性微球与核酸结合，主要是由于磁性微球表面修饰 的DEAE在水溶液中带有正电荷，可与带负电荷的核酸结合，从而达到分离纯化核酸的目 的。但是DEAE与核酸结合能力强，在洗脱过程中需用高浓度的盐溶液洗脱。这给下游核酸 的应用带来不便，因为核酸在低浓度的盐溶液中才能用于下游应用。所以Levison和孙敏 莉用表面修饰DEAE的磁性微球提取核酸后，还需采用乙醇沉淀的方法除去高浓度的盐，然 后再将核酸沉淀重新溶解在缓冲溶液中。因此，该核酸纯化过程费时费力，而且在乙醇沉淀 的过程中造成核酸的损失。
技术实现思路
本专利技术的目的 为了解决
技术介绍
中存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种表面修饰阳离子的 磁性二氧化硅微球的制备方法，依该方法制备出的表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球在 提取核酸时不需高浓度的盐溶液洗脱，省时省力，有效减少了核酸的损失。 解决本专利技术的技术方案 —种，该方法以磁性二氧化硅微 球作为模板，以环氧烷偶联剂3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)作为活化剂， 以阳离子作修饰剂制备成表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球；所述磁性二氧化硅微球是 以四氧化三铁纳米颗粒为核，以正硅酸乙酯作硅源为壳的磁性二氧化硅微球，其特征在于 所述阳离子修饰剂是一类在水溶液中带正电荷的化合物，该阳离子修饰剂pKa值介于4 8之间。 上述制备方法包括以下步骤 (1)制备磁性二氧化硅微球； (2)磁性二氧化硅微球的环氧基化； (3)阳离子表面修饰 (a)将步骤(2)制得的表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与稀盐酸混合，边搅 拌边加热反应； (b)反应完毕后，磁性分离，得到沉淀物，将沉淀物用二次水洗涤； (c)将阳离子修饰剂溶于超纯水中，调节pH值为7 IO，加入步骤(3. 2)洗涤后的沉淀物，搅拌均匀，加热反应； (d)反应完毕后，磁性分离，得到沉淀物，将沉淀物用二次水洗涤，再用预处理溶液 洗涤后，放入预处理溶液中，制备成表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球。 上述阳离子修饰剂为组氨酸、多聚组氨酸、咪唑或其衍生物、2-(N-吗啉代)乙磺 酸或N， N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸。 上述步骤(a)稀盐酸的浓度为0. 01 0. 05mol/L，浓度为0. 01mol/L时效果最 好；表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球与稀盐酸的质量比为1 : 100 500，该比例为 1 : 100 300时效果较好，该比例为1 : 150时效果最好；搅拌速度为600 800转/分 钟，加热至80 IO(TC，反应时间为2 4小时； 上述步骤(c)阳离子修饰剂是一类pKa值介于4 8的化合物，搅拌速度为600 800转/分钟，加热至55 IO(TC，反应时间为4 6小时； 上述步骤(d)预处理溶液的成分是10mM MES、lmM EDTA禾P 10mMNaCl。 上述步骤(2)磁性二氧化硅微球的环氧基化的方法是 (a)取步骤(1)制得的磁性二氧化硅微球与甲苯按质量比为1 : 1000 1100配 成混合溶液，该比例为l : 1020 1080时效果最好；以50 70Hz的频率超声处理10 30分钟; (b)在气体流速为2 3mL/min的氮气保护下，加入3_縮水甘油醚氧基丙基三甲 氧基硅烷，边滴加边以600 800转/分钟搅拌，再以90 ll(TC回流12 24小时，得到沉淀物，所述3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷与步骤(a)的混合溶液的质量比为 1 : 22 26 ; (c)用外部磁铁将步骤(b)得到的沉淀物分离出来，将该沉淀物依次用二甲基甲酰胺、丙酮、无水乙醇、水洗涤后，放入真空干燥箱内，50 7(TC干燥12 24小时，制备成表面键合环氧基的磁性二氧化硅微球。 上述步骤(1)磁性二氧化硅微球的制备方法是 (a)将十六烷基三甲基溴化铵与甲苯按质量比为1 : 12 20混合，该比例为 1 : 12 18时效果最好；以800 1000转/分钟将该混合物搅拌均匀； (b)将FeCl2 4H20与FeCl3 6H20按质量比为1 : 3溶解于二次水中，配制成浓 度为130 150g/L的水溶液；该浓度为140 150g/L效果最好； (c)在气体流速为2 3mL/min氮气保护下以4 5mL/h的速度将步骤(b)的水 溶液滴加到步骤(a)的混合物中，边滴加边以600 800转/分钟持续搅拌4 6小时； (d)加入质量浓度为25%的氨水，以600 800转/分钟持续搅拌2 4小时，有 四氧化三铁纳米颗粒形成，所述氨水与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为0. 1 0. 2 : 1， 该比例为O. 15 0.2 : l时效果最好； (e)再以2 3mL/h的速度滴加正硅酸乙酯，边滴加边以600 800转/分钟搅拌 反应，调节pH值至8 9，滴加完毕1 2小时后，停止通氮气，常温常压下以600 800转 /分钟搅拌4 5天，得到产物，所述正硅酸乙酯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1 1.5 : l，该比例为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球的制备方法，该方法以磁性二氧化硅微球作为模板，以环氧烷偶联剂３－缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷作为活化剂，以阳离子作修饰剂制备成表面修饰阳离子的磁性二氧化硅微球；所述磁性二氧化硅微球是以四氧化三铁纳米颗粒为核，以正硅酸乙酯作硅源为壳的磁性二氧化硅微球，其特征在于：所述阳离子修饰剂是一类在水溶液中带正电荷的化合物，该阳离子修饰剂ｐＫａ值介于４～８之间。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：崔亚丽，杨磊，胡道道，陈超，
申请(专利权)人：陕西北美基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]