同型半胱氨酸诊断试剂盒及同型半胱氨酸浓度测定方法技术

本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的同型半胱氨酸诊断试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定同型半胱氨酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、同型半胱氨酸－α，γ－裂解酶、羟丁酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的程度，从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种同型半胱氨酸诊断试剂盒，同时本专利技术还涉及测定同型半胱 氨酸浓度的方法，属于医学检验测定

技术介绍
测定血浆中同型半胱氨酸浓度的方法有很多种，包括高效液相色谱法(HPLC)、 氨基酸分析仪测定法、离子色谱法、酶联免疫分析法(EIA)、毛细管气相色谱-质 谱，荧光偏振免疫分析(FPIA)、电化学法及酶法等。高效液相色谱法(HPLC):是经典的参考方法，但其操作比较复杂，试验耗时 比较长，试验数据变异比较大，在临床应用方面逐渐被酶联免疫分析法、荧光偏 振分析法和酶法所取代。高效液相色谱法先使用还原剂使血样中所有形式的同 型半胱氨酸转变成还原形式，然后与荧光剂进行衍生生成同型半胱氨酸-荧光物质 复合物，将衍生后的样品进行色谱分析。因色谱固定相对不同物质的吸附力不同， 因此流动相将其洗脱下来的次序也不同，根据这一原理将样品中的不同物质分开， 以荧光检测器检测洗脱下同型半胱氨酸-荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准 品/内标的比值进行比较和计算，就可以测定血总同型半胱氨酸的水平。酶联免疫分析法(EIA):是临床上测定同型半胱氨酸水平的常用方法，操作 比较方便、快捷，重复性好，方法稳定可靠。其缺点是大部分操作还是手工操作，比较耗时。酶联免疫分析法基本分析原理先使用酶将血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成S-腺苷-L-同型半胱氨酸，然后加入酶标的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸 的单克隆或多克隆抗体，采用竞争结合的原理，将不同水平的标准品与酶标抗体 竞争结合，然后以显色试剂和终止试剂分别进行显色和终止，制作出同型半胱氨 酸浓度与发色强度的标准曲线。样品也按相同步骤处理，在标准曲线上就可以查 出其同型半胱氨酸的浓度。离子色谱法主要用于实验研究，临床上较少使用，其基本分析原理是色谱 分析的一种，主要是其固定相采用离子交换物质，根据其对不同离子的吸附力不 同可将同型半胱氨酸与其它物质分开进行测定。毛细电泳法主要用于实验研究，有在临床使用的报道。其特点与高效液相 色谱方法相似，其操作比较复杂、试验耗时较长和试验数据变异比较大的缺点。 基本分析原理先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成还原形式， 然后与荧光试剂进行衍生生成同型半胱氨酸-荧光物质复合物，将衍生后的样品进 行毛细电泳分析。将样品放置于10千伏左右的高压电场中，因为各种物质所带电 荷不同，其等电点也不相同，因此其在电场中的迁移速度也就不同，根据这一原 理可将同型半胱氨酸与样品中的其它物质分开，再以荧光检测器检测同型半胱氨 酸-荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准品/内标的比值进行比较和计算，就可 以测定总同型半胱氨酸的水平。荧光偏振法是临床上测定同型半胱氨酸水平的比较好的方法，该方法完全 自动化仪器分析，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理样品中游离 同型半胱氨酸和抗单克隆抗体相结合的同型半胱氨酸的荧光偏振强度不同，将样 品、标准品与标抗体竞争结合，采用竞争结合的原理制作出同型半胱氨酸浓度与 荧光偏振强度的标准曲线，在标准曲线上就可以查出其同型半胱氨酸的浓度。酶法因应市场需求而新开发出来的测试方法，目前国内有多项专利申请， CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶来测量样品中同型半胱氨酸含量； CN200410016789.6利用同型半胱氨酸转甲基酶(E.C.2丄1.10)及腺苷同型半胱氨 酸酶(E.C.3.3丄1)的循环扩增作用，再加上腺苷脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌 呤氧化酶、过氧化物酶等，或腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶等显色反应测定同型半 胱氨酸含量；CN200510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之 产生硫化氢后再与莹光化合物DMPD2HC1作用产生荧光，该方法使用全自动荧光 分析仪测试，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理用基因重组酶将 同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氢产物再与荧光显色剂发生化学反应形成可测 量的荧光化合物。
技术实现思路
5本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原 型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定同型半胱氨酸浓度的方法，同 时，本专利技术还将给出用以实现该方法的同型半胱氨酸诊断试剂盒，采用该试剂不 仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行同型半胱氨酸浓度测 定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本专利技术同型半胱氨酸浓度测定方法原理如下同型半胱氨酸+水同型半胱氨酸-a.Y-裂解酶硫化氢+氨+cc-氧代丁酸a-氧代丁酸+还原型辅酶 羟丁酸脱氢酶辅酶+羟基丁酸 这种方法应用同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶(homocysteine desulfhydrase; EC 4.4.1.2)酶(偶)联羟丁酸脱氢酶(Hydroxybutyrate dehydrogenase; EC 1.1.1.30)酶促反应比色法。同型半胱氨酸-a，Y-裂解酶酶解同型半胱氨酸反应产生a-氧代丁酸， 再通过(偶)联合羟丁酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收 峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm 处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算同型半胱 氨酸的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是 单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术同型半胱氨酸诊断试剂盒较为理想缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L型半胱氨酸-a，y-裂解酶 6000 U/L羟丁酸脱氢酶 8000 U/L本专利技术的同型半胱氨酸诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、同型半胱氨酸-a，Y-裂解酶、羟丁酸脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸—aj—裂解酶、羟丁酸脱氢酶。 还原型辅酶、同型半胱氨酸-aj-裂解酶、羟丁酸脱氢酶在试剂1或试剂2中 的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。试剂2缓冲液、稳定剂、羟丁酸脱氢酶。试剂3缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸-a，Y-裂解酶。 还原型辅酶、同型半胱氨酸-ocj-裂解酶、羟丁酸脱氢酶在试剂l、试剂2或试 剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定同型半胱氨酸浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的 一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一本实施例的同型半胱氨酸诊断试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的同型半胱氨酸浓度测定方法，其方法原理如下：　同型半胱氨酸＋水　同型半胱氨酸－α，γ－裂解酶　硫化氢＋氨＋α－氧代丁酸　α－氧代丁酸＋还原型辅酶　羟丁酸脱氢酶　辅酶＋羟基丁酸　将最终反应物置于紫 外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的程度，测算出同型半胱氨酸的浓度大小测定结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]