本发明专利技术涉及乙肝的诊断试剂，公开了一种乙型肝炎表面抗原的检测微粒，为乙型肝炎表面抗体包被的发光微粒。本发明专利技术还公开了上述乙型肝炎表面抗原检测微粒的制备及应用。此外，本发明专利技术又进一步公开了一种测定样品中乙型肝炎表面抗原的体外诊断试剂盒，同时公开了该试剂盒的使用方法。本发明专利技术的试剂盒，可以与其它血清和临床信息联合用于诊断个体发生急性或慢性乙型肝炎感染的情况，也可用于对围产期女性乙型肝炎的筛选，以判断新生儿感染乙型肝炎的危险性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及乙肝的诊断试剂，具体涉及基于光激化学发光原理的乙型肝炎病毒表面抗 原(HBsAg)检测颗粒、其制备及应用。
技术介绍
免疫学检测是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同 位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质，激 素等微量生物活性物质。我国免疫学检测基本经历了放射免疫检测(兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于 县级以上医院)；酶联免疫检测(兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用)；以化学 发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术(20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长 期)三个阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性 的需求的不断提高而决定的。化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年来在世界范围内发展 非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并籍助其发 光强度直接测定免疫结合。由于其高灵敏度，检测范围宽等优点，已成为放射性免疫分析 与普通酶免疫分析的取代者，是免疫学检测重要的发展方向。但目前国内自行研制的化学发光检测试剂，大多为非均相反应，采用化学底物直接标 记，通过化学反应激发。其分析过程与传统酶标检测类似，需反复清洗与分离，检测耗时 长，自动化程度不高。国外厂家检测试剂随发光基质与检测形式而各不相同。以Abbott, Bayer与Chiron等公司为代表的化学激发，即以化学发光底物直接标记抗原或抗体进行免 疫测定。最常用的为吖啶酯，在碱性环境中可被过氧化氢氧化而发光。BD则以AKP,金钢 脘为基质采用酶促化学发光。Roche为则采用电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)，发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧 化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即 释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光 子而常保持底物浓度的恒定。因反应过程中牵涉到分离清洗，自动化设计复杂，仪器相当6昂贵。此外，发光基质的稳定性也是一大问题。光激化学发光法通过引入激光技术与纳米微球技术，成功地解决了上述不足。因反应 在均相中进行，既加快了反应速度，又避免了反复分离与清洗步骤，能有效降低检测背景 值，减少反应时间，并可实现自动化操作。目前，PE公司推出了针对生物研究用的光激化 学发光试剂Alpha-Screen。但在临床检测领域，还没有面世的光激化学发光检测试剂，尤 其是用于肿瘤标志物与肝炎检测项目。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可用于定性或定量检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的检测微 粒，其制备、检测条件及应用。本专利技术的技术原理本专利技术的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)检测试剂及试剂盒与光激化学发光检测技术相关， 光激化学发光免疫技术是一种利用化学发光物质发射的光波进行免疫测定的方法。该技术 主要整合了高分子微粒技术，有机合成，蛋白质化学与临床检测相关领域的研究。本专利技术之所以能检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，是由于在均相条件下，将内部带有染 料的感光微粒(纳米级)以及包被有表面抗体(HBsAb)并且内部带有发光化合物的发光微粒 (纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。此时纳米感光微粒和包被有表面抗体(HBsAb) 的纳米发光微粒可迅速有效地捕捉HBeAg，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光 照射后，纳米感光微粒中的染料被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该 高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微粒俘获，从而传递能量以激活所述发光微粒中 的发光化合物。数微秒后，发光微粒中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器 测定这些高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地 反映了目标分子的浓度。而当样本不含HBeAg时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活 性氧离子也无法传递至发光微粒表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无高能级 红光产生。具体原理参见图1及图2。基于上述原理，本专利技术第一方面提供了一种用于检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的检测 微粒，为乙型肝炎表面抗体(冊sAb)包被的发光微粒。本专利技术第二方面提供了一种乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的检测试剂盒，包括上述表面抗 体(HBsAb)包被的发光微粒。试剂盒中，还可包括生物素标记的乙型肝炎表面抗体(HBsAb)和亲和素包被的感光微粒。在试剂盒中，上述表面抗体(HBsAb)包被的发光微粒、生物素标记的表面抗体(HBsAb)和亲和素包被的感光微粒分别独立包装，且均为混悬液。上述含有表面抗体(HBsAb)包被的发光微粒、生物素标记的表面抗体(HBsAb)或亲和素包被的感光微粒的溶液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如服PES缓冲体系、Tris缓冲体系。表面抗体(HBsAb)包被的发光微粒的溶剂优选pH8. 0的成分为HEPES、 NaCl和EDTA-Na-2H20的HEPES缓冲液，生物素标记的表面抗体(HBsAb)的溶剂优选p朋.0的成分为Tris、 NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris缓冲液，亲和素包被的感光微粒的溶剂优选HEPES、 NaCl和EDTA-Na-2H20的HEPES缓冲液，上述各种溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试剂如Tween20，出于对试剂防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，防腐剂优选100U/ml庆大霉素和质量百分比为万分之五的Proclin 300作为防腐剂。在用于定量检测乙型肝炎表面抗原时，上述试剂盒中还可包括定标品，即含有多种确定浓度乙型肝炎表面抗原的溶液。上述不同乙型肝炎表面抗原浓度的溶液分别独立包装。用于定性检测乙型肝炎表面抗原时，上述试剂盒中还可包括阳性对照、阴性对照，以及参考样品，上述参考样品为含有确定浓度乙型肝炎表面抗原的溶液。上述阳性对照、阴性对照，以及参考样品分别独立包装。含有确定浓度乙型肝炎表面抗原的溶液中乙型肝炎表面抗原的浓度为乙型肝炎表面抗原临床cutoff点对应的浓度。上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒。发光化合物可以是Dioxene (二氧杂环己烯)或thioxene (二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu (TTA) 3/T0P0或Eu (TTA) 3/Phen等，该微粒可由市场上购得。研究发现，由于最终的检测反应是均相反应，发光微粒的粒径(微粒的平均直径)太大(〉400ntn)会自然沉降，影响检测效果，微粒的粒径太小(<50nm),会使制备过程中的清洗工作比较困难，对抗体连接工作不利，因此发光微粒的粒径范围应在50-400nm之间，较好为100-300nm之间，优选250nm。发光微粒的表面官能团可以是任何能联接蛋白质的基团，但最常用的主要有羧基和醛基表面官能团的微粒。使用不同的微粒表面官能团，连接抗体的反应方式和条件也不相同。鉴于获得更好的表面抗体(HBsAb)连接效率，试剂稳定性和连接重复性，经试验优选醛基表面本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乙型肝炎表面抗原的检测微粒，为乙型肝炎表面抗体包被的发光微粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，吴旸，王海蛟，赵卫国，
申请(专利权)人：博阳生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。