本发明专利技术提供了一种牡丹ＡＣＣ氧化酶基因Ｐｓ－ＡＣＯ１特异性探针，其具有序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的核苷酸序列，或者其有效长度片段。实验表明，本发明专利技术探针能够用于Ｐｓ－ＡＣＯ１基因的特异性检测，为探明牡丹切花开放衰老进程中ＡＣＯ基因是否存在调控作用，为其采后保鲜技术的开发、乃至转基因育种提供理论依据。
Ps-ACO1 specific probe of ACC oxidase gene of peony
The invention provides a peony ACC oxidase gene Ps ACO1 specific probe, which has a nucleotide sequence shown in a sequence table SEQ ID NO.1, or the effective length of fragment. Experiments show that the probe can be used for specific detection of Ps ACO1 gene, to explore the flower opening and senescence process in the existence of ACO gene regulation, and provide a theoretical basis for the development and postharvest preservation technology and transgenic breeding.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及牡丹ACC氧化酶基因 iVJC(97的特异性探针。
技术介绍
牡丹(尸"eom'a w,w"cora )是中国传统名花中的精品，素有"国 色天香"、"花中之王"的美誉，它花大色艳，不仅深受我国人民的喜 爱，而且也符合西方人的审美观，因此逐渐成为目前世界上最流行的 花木之一。近年来，随着巿场对鲜切花需求的日益增长，除了园林用 苗及盆花以外，牡丹切花的潜在国际巿场也日趋扩大。然而，由于牡 丹自然花期集中、单朵花花期短、采后贮运保鲜技术不过关，致使鲜 切花质量难以保证、无法实现长期和远距离供货，这不仅成为制约我 国牡丹切花产业化生产的重要因素之一，而且为此还失去了很多创汇 良机。被称为衰老激素的乙烯与切花衰老的关系密切，多年来一直是切 花衰老研究的热点。目前，已发现乙烯的大量产生是促使牡丹切花衰 老的重要生理原因之一(史国安等，1997， 1999);在此基础上，我 们对13个牡丹品种内源乙烯代谢特征进行分析发现，以牡丹'洛阳 红，为代表的几种切花乙烯释放量与花朵开放衰老进程密切相关(Jia etal.，2006)，但其对外源乙烯的反应却非常复杂(Zhou et al.， 2006 )。 因此，为了探明乙烯在牡丹切花开放衰老进程中的作用机理，从而为 其釆后保鲜技术的开发提供理论依据，还需要更深入的研究。自乙烯生物合成途径揭示以来(Yang and Hoffman, 1984)，切花 乙烯致衰机理的研究逐渐进入到分子水平。在乙烯生物合成途径中， 有ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)两个关键酶。其中，ACO在植物乙烯生物合成途径中将ACC氧化生成乙烯，是整个过程中的最后一个酶。早期的研究表明，把外源的ACC供给植物组织就能使乙烯的生成量增加，从而认为它是组成性的，不构成乙烯生物合成的限速酶。但近年来也有一些研究发现，IAA能够促进乙烯产量的 增加是通过乙烯自身诱导了 ^CO基因的转录来实现的，因此，ACO 也有可能是影响乙烯生物合成途径中的一个限速酶，并且^C(9基因 的表达是非组成型的，其转录水平上的调控可能控制着乙烯的生成速 率(ten Have and Woltering， 1997)。目前，鍔梨(McGarvey a/" 1990)、香石竹(Woodson etal., 1992)、杉^ ( Callahan et al.， 1992)、 苹果(Dongetal.， 1992 )、蝴蝶兰(O'Noill et al.， 1993 )、拟南芥(Kieber etal., 1997)等物种的ACO基因cDNA克隆已相继获得，有关爿CO 基因的表达分析研究也已在多种切花中开展起来，其中以模式植物香 石竹研究得最为深入，现已通过导入反义JCO基因成功抑制了其自 身的表达，使得乙烯产量显著下降，花瓣卷缩受到抑制，切花寿命明 显延长(Savineta1.,1995)。迄今为止，有关乙烯在牡丹切花釆后衰老中的作用机理研究仍为 空白，更没有分子水平上的相关研究。为探明牡丹切花开放衰老进程 中JCO基因是否存在调控作用，为其釆后保鲜技术的开发、乃至转 基因育种提供理论依据，牡丹'洛阳红'花瓣中的P^4COf被首次 分离，并合成了该基因的特异性探针，避免了在基因表达分析研究中 因为同源性较高而带来的其它基因家族成员的表达干扰，有利于在此 基础上研究JCO不同成员在牡丹乙烯反应中的调控机理及作用模 式。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供牡丹ACC氧化酶基因iV^Q9/的特异性 探针，为A"CO/基因的后续功能研究和应用提供基础。本专利技术所述的特异性探针具有序列表SEQ ID NO.l所示的核苷酸序列或者其有效长度片段。本领域技术人员应能理解，这里所述的有效长度片段是按照SEQ ID NO.l产生的指能够与尸^4C"特异杂 交的序列。这些序列长度优选60bp以上。探针的标记物可以是放射性标记或者是非放射性标记，例如釆用荧光标记。可以将上述探针与适当的试剂组成试剂盒，以方便使用。 通过实验表明，本专利技术探针具有良好的特异性，能够用于AJCO/基因的特异性检测。本专利技术首次从牡丹'洛阳红'花瓣中分离iV^C07基因，并合 成了该基因的特异性探针，避免了在基因表达分析研究中因为同源性 较高而带来的其它基因家族成员的表达干扰，有利于在此基础上研究 ^CO不同成员在牡丹乙烯反应中的调控机理及作用模式。为探明牡 丹切花开放衰老进程中JCO基因是否存在调控作用，为其釆后保鲜 技术的开发、乃至转基因育种提供理论依据。附图说明图1 /^"CO 基因cDNA全长核苷酸及推定的氨基酸序列； 图2 BlastP推导的A-JCO/氨基酸序列保守区预测； 图3 牡丹A"CO 基因Southern杂交分析，将'洛阳红，幼 嫩叶片中提取的30|ag DNA，以￡coRI (a)、五coRV(b)、历"Jin(c) 进行酶切，0.8% (w/v)琼脂糖凝胶电泳分离后，转移至尼龙膜上，以地高辛标记的特异片段作为探针进行杂交；图4 乙烯和1-MCP处理对'洛阳红，花瓣内尸s"ca 基因表达的影响，切花在测定乙烯生成量后立即用来花瓣取样提取总RNA, 每个泳道为20 ja g总RNA,以rRNA为内参来衡量总RNA上样量。 数字代表牡丹切花的开花指数。每次杂交均重复至少两次。具体实施例方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。实施例l A"CO/基因的克隆1. 牡丹花瓣总RNA的提取(1) RNA提取所用的塑料、玻璃器皿和试剂配制均按《分子 克隆实验指南》(第三版)进行去除Rnase处理。(2) 取牡丹'洛阳红，盛开期花朵的花瓣样品l.Og，液氮中研 磨至粉末后，迅速转入1.5mL离心管中，加入65T预热的CTAB提 取液600 ja L ( 2 % CTAB， 2 % PVP, 100 mM TrisCl (pH8.0), 10 mM NaCl， 25 mM EDTA (pH8.0) , 2% P-巯基乙醇(使用前加入))，盖 紧盖子，立即剧烈涡旋振荡30s,使粉末完全分散在溶液中，65'C温 洛2-5min，期间剧烈涡旋振荡3-5次，冷却至室温后，向上述混合 液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提两次，每次涡旋振荡5 min后，室温或18X:下10,000 rpm离心15 min,转移上清至新的离 心管中，加入1/4体积lOMLiCl,混匀，4。C过夜沉淀后，4°C， 10,000 rpm离心20min收集沉淀，用500 n L SSTE ( 1.0M NaCl， 0.5% SDS, 10mMTrisCl， 1 mM EDTA )缓冲液溶解沉淀，加入等体积的氯仿/ 异戊醇再抽提l-2次。转移上清后加入2倍体积无水乙醇，-2(TC放 置2 h或—70。C放置30 min， 4'C ， 10， 000 rpm离心20 min,沉淀RNA, 先后用500 jaL70y。乙醇、500 iaL无水乙醇漂洗沉淀，本文档来自技高网...
【技术保护点】
牡丹ＡＣＣ氧化酶基因Ｐｓ－ＡＣＯ１特异性探针，其具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的核苷酸序列，或者其有效长度片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：董丽，周琳，贾培义，王玮然，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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