本发明专利技术公开了一种用于培养微生物表达肝素酶的培养基。该培养基，是含有５－２０ｇ／Ｌ酵母提取物，０．５－２０ｇ／Ｌ葡萄糖，０．０５ｍＭ－５．０ｍＭ钙离子的培养基。所述培养基中还含有１０．０－２５．０ｇ／Ｌ Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］.１２Ｈ↓［２］Ｏ，１．０－５．０ｇ／Ｌ ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］，０．１－１．０ｇ／ＬＮａＣｌ；０．５－５．０ｇ／Ｌ ＮＨ↓［４］Ｃｌ。重组肝素酶能够在上述培养基中高量表达，最高的肝素酶酶活达２０６５２．６３ＩＵ／Ｌ发酵液，远远高于普通的ＬＢ培养基的表达效果。该培养基大大地降低了肝素酶的生产成本，对于肝素酶的应用，尤其是酶法制备低分子量肝素具有极其显著的经济意义。
Culture medium for culturing microorganisms expressing heparanase
A culture medium for culturing microorganisms expressing heparanase is disclosed. The culture medium containing 520g / L yeast extract, 0.520g / L glucose medium 0.05mM5.0mM calcium ion. The medium containing 10 25.0g / L Na: 2 HPO: 4.12H: 2 O, 1 5.0g / L KH: 2 PO: 4, 0.1 1.0g / LNaCl; 0.5 5.0g / L NH: 4 Cl. Recombinant heparanase can be expressed in high level in the medium, and the highest enzyme activity of heparin reaches 20652.63IU / L fermentation broth, which is much higher than that of the normal LB medium. The culture medium greatly reduces the production cost of heparin enzyme, and has extremely significant economic significance for the application of heparanase, especially for the preparation of low molecular weight heparin by enzyme method.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于培养微生物表达肝素酶的培养基，涉及一种用于培养微生 物表达肝素酶融合蛋白的培养基。
技术介绍
肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素的多糖裂解酶，在许多种微生物中发 现，包括棒杆菌Coo;"e6"cto^m sp.(高宁国等，肝素酶产生菌的筛选及发酵条件, 微生物学报 1999Vol.39:64-67)、鞘胺醇杆菌5^/"go6a"m'wm sp.(高宁国等，鞘 胺醇杆菌肝素酶的产生，微生物学报2003 Vol.43:813-816)、枯草芽胞杆菌^c/〃w (王忠彦等，肝素酶产生菌的筛选及其粗酶性质的研究，四川大学学报(自 然科学版)2002 Vol,39:777-779)、环状芽孢杆菌5ac/〃w ">c"/<my (Yasutaka Tahara et al" Purification and characterization of heparinase that degrades both heparin and heparin sulfate from 5a"'〃"j ">rw/am BioSci. Biotechnol. Biochem. 2002 Vol.66:1181國1184)、角牟肝素拟杆菌尸/rvote〃a / ，r/"o/,'ca (Kazuyuki Sugahara et al" Characterization of heparinase from an oral bacterium /Vevote〃a Ae/ ah"o/y"ca J.Biochem.1998 Vol.l23:283-288)、粪便拟杆菌5a"eraWey WercoWs HJ-15 (Dong Hyuu Kim et al" Purification and characterization of a novel heparinase from 5a"erazVfey Wercon's HJ-15 J.Biochem.2000 Vol.128: 323-328 )和肝素黄杆菌 F/flva6a"eW, /ze/ ar/"wm (Sasiekharan,R. 1991 Ph.D. Thesis, Havard University )。 但是来自肝素黄杆菌的肝素酶是商业化的唯一来源。来自肝素黄杆菌的肝素酶主要 有三种，分别命名为肝素酶I(EC 4.2.2.7)、 II(NO EC code)和III(EC 4.2.2.8)(Robert J. Linhardt et al" Purification and characterization of heparin lyases from M譜Z a"m'騰/2e,Zn, JBC 1992 Vol.267:24347-24355)。其中肝素黄杆菌的肝素酶I (hepA)是目前为止研究最充分的肝素酶之一，其 在低分子肝素的生产和体外血液循环中肝素的去除上的应用已有报道，具有巨大的 市场开发价值。由于肝素黄杆菌产肝素酶I的表达量低并且纯化操作繁琐且费用较 高，因而重组菌生产肝素酶I受到极大的关注。肝素酶的研究有十分重要的意义(Sasiekharan，R. 1991 Ph.D. Thesis, Havard University; Sasiekharan，R.et al"A comparative analysis of the primary sequences and characteristics of heparinase I,II,and III from F/avo6acfen'薩A印ar/"簡Biochemicaland Biophysical Research Communication 1996 Vol.229:770-777):肝素酶是多糖裂解 酶的一种，用于研究肝素酶及其底物多糖肝素之间的相互作用有助于阐明多糖裂解 酶的作用机制；肝素酶可以用于解析肝素等复杂粘多糖的结构及其生物学功能；肝 素酶可以用于解析人体内的凝血和抗凝血机制；肝素酶可以用于制备低分子的抗凝 血药物低分子肝素；肝素酶可以用作临床血液肝素化的去除，防止手术后出血；肝 素酶用于PCR反应前血液制品的处理。目前肝素酶I通常是从肝素黄杆菌发酵液中提纯获得的，需要经过多步的色谱 纯化，收率比较低。肝素黄杆菌增长速度慢，肝素酶的生产稳定性差，而且，产肝 素酶需要价格昂贵的肝素诱导，而且需要经过多步的纯化步骤，收率较低，造成酶 的成本非常昂贵(肝素黄肝菌产生的商品肝素酶的价格为40美元/U)，极大地增加了 酶的成本。因此，目前利用黄杆菌生产肝素酶的成本极高，限制了肝素酶的应用发 展。利用重组菌株生产肝素酶I是一条极有前景的途径，但通常情况下重组肝素酶 I极容易形成包涵体，需要复杂的复性过程才能形成活性蛋白。本实验室利用麦芽 糖结合蛋白融合技术构建了表达融合肝素酶的基因工程菌株大肠杆菌TBI (pMAL-hepA)，实现了肝素酶I卯％以上的高效可溶性表达(陈银，邢新会，娄 恺，CN1699424, 2005)。重组肝素酶的表达通常是采用最常用的LB培养基(胰蛋 白胨Tryptone 10 g/L，酵母提取物Yeast Extract 5 g/L， NaCl 10 g/L， pH 7.0)，但经 由它所培养出的重组大肠杆菌￡.co// TBI (pMAL-hepA)最高OD,通常在2.000 一2.500之间，肝素酶酶活则为1400—2000 IU/L发酵液(1 IU的酶活的定义为30°C 每分钟产生lpmol不饱和键的反应效力)。此外，LB培养基中的胰蛋白胨和酵母提 取物均为成分复杂的组分，每批次产品成分含量变化也比较大，不利于对菌体生长、 蛋白表达和分离纯化等实验研究的开展，而且LB培养基的成本也相对较高，因此 探究一种既能提高肝素酶I的可溶性表达量又能降低酶生产成本成分相对较简单的 培养基具有极其重要的研究价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于培养微生物表达肝素酶的培养基。本专利技术所提供的用于培养微生物表达肝素酶的培养基，是含有5-20 g/L酵母提 取物，0.5-20 g/L葡萄糖，0.05mM-5.0mM钙离子的培养基。所述培养基中还含有10.0-25.0 g/L Na2HP04'12H20， 1.0-5.0 g/L KH2P04, 0.1-1.0 g/L NaCl; 0.5-5.0 g/L NH4C1。所述培养基中Na2HP(V12H20的含量优选为17.1 g/L， KH2P04的含量优选为 3.0 g/L， NaCl的含量优选为0.5 g/L， NH4C1的含量优选为1.0 g/L。所述培养基中，所述酵母提取物的含量为12.5g/L;所述葡萄糖的含量为12g/L， 所述钙离子的含量为1.0mM。上述培养基中，所述钙离子通过CaCl2加入。 上述肝素酶为麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白。上述微生物为转入可表达所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白的重组质 粒的工程菌。本专利技术的培养基的组分通过了优化筛选，重组肝素酶能够在其中高量表达，具 有高酶活和比活，本专利技术的培养基发酵培养工程菌诱导表达麦芽糖结合蛋白和肝素本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于培养微生物表达肝素酶的培养基，是含有５－２０ｇ／Ｌ酵母提取物，０．５－２０ｇ／Ｌ葡萄糖，０．０５ｍＭ－５．０ｍＭ钙离子的培养基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邢新会，叶逢春，陈银，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。