ＧＬＰ－１融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及与一些蛋白融合的胰高血糖素样肽－１（ＧＬＰ－１）化合物，所述蛋白具有延长胰高血糖素样肽－１化合物的体内半衰期的作用。这些ＧＬＰ－１融合蛋白可以用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病和各种状况。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
GLP-1融合蛋白 本申请是申请日为2001年11月29日，申请号为01620232. 2的、专利技术名称和本发 明相同的专利技术专利申请的分案申请。 本专利技术涉及与一些蛋白融合的胰高血糖素样肽，包括其类似物和衍生物，所述蛋 白具有延长胰高血糖素样肽的体内半衰期的作用。这些融合蛋白可以用于治疗非胰岛素依 赖型糖尿病和各种状况。 胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)是一个含有37个氨基酸的、可对食物摄入作出应答 的肽，是由肠L-细胞分泌的。已经发现胰高血糖素样肽-l可剌激胰岛素分泌(促胰岛 素活性)，从而引起细胞对葡萄糖的吸收和血清葡萄糖水平下降(见如Mojsov， S. ， Int. J. P印tide ProteinResearch， 40 :333-343(1992))。然而，GLP-1活性很低。随后在第6位 和第7位之间的内源性裂解产生了生物活性更强的GLP-1 (7-37)0H肽。已知有很多GLP-1 类似物和衍生物，在此称作GLP-1化合物。这些GLP-1类似物包括GILA毒蜥(monster) 毒液中的Exendins。 Exendins具有与天然GLP-1同源的序列，结合GLP-1受体并起始由 GLP-1 (7-37) OH引起的负责多种活性的信号传导级联。 GLP-1化合物具有各种重要的生理活性。例如，已经证明GLP-1剌激胰岛素释放， 降低胰高血糖素分泌，抑制胃排空，并且增强葡萄糖利用。[N塞k，M丄，et al. (1993) Diabetologia 36 :741-744 ;Gutniak， M. ， et al. (1992)New England J. of Med. 326 : 13161322 ;Nauck， M. A. ， et al. ， (1993)J. Clin. Invest. 91 :301307]。 GLP-1表现出作为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的治疗方法的最大潜能。市场 上已经有许多口服药物，用于治疗与NID匿相关的胰岛素抵抗。然而，当疾病进展时，患者 必须开始剌激胰岛素释放，并最终进行涉及胰岛素注射的治疗。然而，当前剌激胰岛素释放 的药物和胰岛素的实际给药也可导致低血糖症。GLP-1活性受血糖水平的控制。当该水平 降低到某一域值水平时，GLP-1无活性。因此。没有发生与GLP-1治疗相关的低血糖症的 危险。 然而，涉及GLP-1肽的治疗的用途受到了它们的迅速清除和短半衰期的限制。例 如，GLP-1 (7-37)的血清半衰期仅仅为3-5分钟。当皮下给药时，GLP-1 (7_36)酰胺的作用 时间为约50分钟。甚至抗内源性蛋白酶裂解的类似物和衍生物也没有足够长的半衰期以 避免在24小时的时间段中重复给药。当需要在长时间内维持治疗剂的高血液水平时，治疗 剂的迅速清除是不方便的，因为必须重复给药。此外，长作用时间的化合物对于过去的治疗 方案只包括口服药物的糖尿病患者特别重要。这些患者通常对于包括多次药物注射的方案 具有极为困难的时间过渡。 本专利技术克服了与递送具有短血清半衰期的化合物相关的问题。本专利技术包括与另一 种具有长的循环半衰期的蛋白，如免疫球蛋白或白蛋白的Fc部分融合的GLP-1化合物。 —般地，小的治疗性肽难以操作，因为即使是它们的结构中的轻微改变也可以影 响稳定性和/或生物活性。对于目前开发中的GLP-1化合物来说更是如此。例如，例如， GLP-1 (7-37)0H具有进行构象改变的倾向，从主要为a螺旋结构改变成主要为P折叠结 构。P折叠的形成导致被认为是无活性的物质的聚集。因此，能够开发半衰期增加的生物活性GLP-1融合蛋白是出乎意料的。因此，由于对GLP-1(737)0H本身和相对于所连接的GLP-1肽来说很大的融合配偶体进行工作的困难，这尤其是预料不到的。 本专利技术的化合物包括一种异源融合蛋白，它包含第一个多肽，该多肽具有N末端和与具有N末端和C末端的第二个多肽融合的C末端，其中第一个多肽是GLP-1化合物，并且第二个多肽选自 a)人白蛋白； b)人白蛋白类似物；禾口 c)人白蛋白的片段， 并且其中第一个多肽的C末端与第二个多肽的N末端融合。 本专利技术的化合物还包括一种异源融合蛋白，它包含第一个多肽，该多肽具有N末端和与具有N末端和C末端的第二个多肽融合的C末端，其中第一个多肽是GLP-1化合物，并且第二个多肽选自 a)人白蛋白; b)人白蛋白类似物；禾口 C)人白蛋白的片段， 并且其中第一个多肽的C末端通过肽接头与第二个多肽的N末端融合。肽接头优 选选自 a)富含甘氨酸的肽； b)具有序歹lj [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n是1，2，3，4，5或6 ;禾口 c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。 本专利技术的其它化合物包括一种异源融合蛋白，包含第一个多肽，该多肽具有N末端和与具有N末端和C末端的第二个多肽融合的C末端，其中第一个多肽是GLP-1化合物，并且第二个多肽选自 a)免疫球蛋白的Fc部分； b)免疫球蛋白的Fc部分的类似物；禾口 c)免疫球蛋白的Fc部分的片段， 并且其中第一个多肽的C末端与第二个多肽的N末端融合。GLP-1化合物可以通 过肽接头与第二个多肽融合。肽接头优选选自 a)富含甘氨酸的肽； b)具有序歹lj [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n是1，2，3，4，5或6 ;禾口 c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。 作为异源融合蛋白的一部分的GLP-1化合物一般优选具有不超过6个不同于 GLP-1 (7-37) OH， GLP-1 (7-36) OH或Exendin-4中的相应氨基酸的氨基酸。GLP-1化合物 甚至更优选具有不超过5个不同于GLP-1 (7-37) 0H， GLP-1 (7-36) OH或Exendin-4中的相 应氨基酸的氨基酸。GLP-1化合物最优选具有不超过4， 3或2个不同于GLP-1 (7_37)0H， GLP-1 (7-36) OH或Exendin-4中的相应氨基酸的氨基酸。GLP-1化合物优选为第8位具有 甘氨酸或缬氨酸的异源融合蛋白的一部分。 本专利技术还包括编码此处描述的异源融合蛋白的多核苷酸，包含这些多核苷酸的载 体，和用此处描述的载体转染或转化的宿主细胞。还包括一种产生异源融合蛋白的方法，该方法包括在以可检测量表达异源融合蛋白的条件下转录和翻译此处描述的多肽的步骤。 本专利技术还包括一种使有需要的哺乳动物中的血糖水平正常化的方法，包括给予治疗有效量的此处描述的异源融合蛋白。 参考以下附图对本专利技术进行进一步描述 附图说明图1 :包括铰链区，CH2和CH3结构域的IgGl Fc氨基酸序列。 图2 :人血清白蛋白氨基酸序列。 图3 :A. SDS-PAGE凝胶和同一凝胶的免疫印迹，描述IgGl-Fc和GLP_l_Fc融合蛋白的分子量(第1道，分子量标准；第2道，纯化的Fc ;第3道，伪转化的培养基；第4道，Val8-GLP-1-Fc ;第5道，Exendin-4-Fc) 。 B. SDS-PAGE凝胶和同一凝胶的免疫印迹，描述人HSA和GLP-l-HSA融合蛋白的分子量(第1道，分子量标准；第2道，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异源融合蛋白，其具有第一个多肽，该多肽具有Ｎ末端和与具有Ｎ末端和Ｃ末端的第二个多肽融合的Ｃ末端，其中第一个多肽是具有式Ⅰ，即ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示序列的ＧＬＰ－１化合物　　７　８　９　１０　１１　１２　１３　１４　１５　１６　１７Ｈｉｓ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｘａａ－Ａｓｐ－Ｘａａ－Ｘａａ－　　１８　１９　２０　２１　２２　２３　２４　２５　２６　２７　２８　　Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｐｈｅ－　　２９　３０　３１　３２　３３　３４　３５　３６　３７　３８　３９　　Ｉｌｅ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－　　４０　４１　４２　４３　４４　４５　　Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｘａａ　　式Ⅰ　（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：２）　　其中：　　第８位的Ｘａａ是Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ或Ｖａｌ；　　第９位的Ｘａａ是Ｇｌｕ或Ａｓｐ；　　第１１位的Ｘａａ是Ｔｈｒ；　　第１４位的Ｘａａ是Ｓｅｒ；　　第１６位的Ｘａａ是Ｖａｌ，Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｔｒｐ或Ｐｈｅ；　　第１７位的Ｘａａ是Ｓｅｒ；　　第１８位的Ｘａａ是Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，或Ｌｙｓ；　　第１９位的Ｘａａ是Ｔｙｒ或Ｇｌｎ；　　第２０位的Ｘａａ是Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，或Ｐｈｅ；　　第２１位的Ｘａａ是Ｇｌｕ；　　第２２位的Ｘａａ是Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ或Ｇｌｎ；　　第２３位的Ｘａａ是Ｇｌｎ或Ｇｌｕ；　　第２４位的Ｘａａ是Ａｌａ；　　第２５位的Ｘａａ是Ａｌａ；　　第２６位的Ｘａａ是Ｌｙｓ，Ａｒｇ或Ｈｉｓ；　　第２７位的Ｘａａ是Ｌｅｕ，Ｇｌｕ或Ｉｌｅ；　　第３０位的Ｘａａ是Ａｌａ，Ｇｌｕ或Ａｓｐ；　　第３１位的Ｘａａ是Ｔｒｐ；　　第３２位的Ｘａａ是Ｌｅｕ；　　第３３位的Ｘａａ是Ｖａｌ，Ａｌａ，Ｉｌｅ或Ｌｙｓ；　　第３４位的Ｘａａ是Ａｓｎ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ或Ｇｌｙ；　　第３５位的Ｘａａ是Ｇｌｙ；　　第３６位的Ｘａａ是Ｇｌｙ，Ａｒｇ或Ｈｉｓ；　　第３７位的Ｘａａ是Ｐｒｏ，Ｇｌｙ或被去除；　　第３８位的Ｘａａ是Ｓｅｒ或被去除；　　第３９位的Ｘａａ是Ｓｅｒ或被去除；　　第４０位的Ｘａａ是Ｇｌｙ，Ｓｅｒ或被去除；　　第４１位的Ｘａａ是Ａｌａ或被去除；　　第４２位的Ｘａａ是Ｓｅｒ，Ｐｒｏ或被去除；　　第４３位的Ｘａａ是Ｓｅｒ，Ｐｒｏ或被去除；　　第４４位的Ｘ...

【技术特征摘要】
US 2000-12-7 60/251954一种异源融合蛋白，其具有第一个多肽，该多肽具有N末端和与具有N末端和C末端的第二个多肽融合的C末端，其中第一个多肽是具有式I，即SEQ ID NO2所示序列的GLP-1化合物7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39I1e-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-40 41 42 43 44 45Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa式I (SEQID NO2)其中第8位的Xaa是Ala，Gly，Ser或Val；第9位的Xaa是Glu或Asp；第11位的Xaa是Thr；第14位的Xaa是Ser；第16位的Xaa是Val，Ala，Leu，Ile，Trp或Phe；第17位的Xaa是Ser；第18位的Xaa是Ser，Tyr，或Lys；第19位的Xaa是Tyr或Gln；第20位的Xaa是Leu，Met，或Phe；第21位的Xaa是Glu；第22位的Xaa是Gly，Ser，Glu，Asp或Gln；第23位的Xaa是Gln或Glu；第24位的Xaa是Ala；第25位的Xaa是Ala；第26位的Xaa是Lys，Arg或His；第27位的Xaa是Leu，Glu或Ile；第30位的Xaa是Ala，Glu或Asp；第31位的Xaa是Trp；第32位的Xaa是Leu；第33位的Xaa是Val，Ala，Ile或Lys；第34位的Xaa是Asn，Lys，Arg或Gly；第35位的Xaa是Gly；第36位的Xaa是Gly，Arg或His；第37位的Xaa是Pro，Gly或被去除；第38位的Xaa是Ser或被去除；第39位的Xaa是Ser或被去除；第40位的Xaa是Gly，Ser或被去除；第41位的Xaa是Ala或被去除；第42位的Xaa是Ser，Pro或被去除；第43位的Xaa是Ser，Pro或被去除；第44位的Xaa是Gly，Pro或被去除；并且第45位的Xaa是Ala，Ser或被去除；前提是当第37，38，39，40，41，42，43或44位的氨基酸被去除时，该氨基酸下游的所有氨基酸也被去除；第二个多肽是人白蛋白，其中，第一个多肽的C末端与第二个多肽的N末端融合。2.一种异源融合蛋白，其具有第一个多肽，该多肽具有N末端和与具有N末端和C末端的第二个多肽融合的C末端，其中第一个多肽是具有式工，即SEQ工D N。2所示序列的GLP-l化合物 ` 789lol l121314151617Hi S-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-`1819202l22232425262728Xaa一一Xaa一一Xaa一一Xaa一一Xaa一一Xaa一一Xaa一一Xaa一一Xaa一一Xaa一一Phe一一`29303l3233343536373839工1 e-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa一`404l42434445Xaa一一Xaa一一Xaa一一Xaa一一Xaa一一Xaa式工 (SEQID NO2)其中第8位的Xaa是Ala，Gly，Set或Val；第9位的Xaa是Glu或Asp；第11位的Xaa是Thr；第14位的Xaa是Set；第16位的Xaa是Val，Ala，Leu，工le，Trp或Phe；第17位的Xaa是Set；第18位的Xaa是Set，Tyr，或Lys；第19位的Xaa是Tyr或Gln；第20位的Xaa是Leu，Met，或Phe；第2l位的Xaa是Glu；第22位的Xaa是Gly，Set，Glu，Asp或Gln；第23位的Xaa是Gln或Glu；第24位的Xaa是Ala；第25位的Xaa是Ala；第26位的Xaa是Lys，Arg或His；第27位的Xaa是Leu，Glu或11e；第30位的Xaa是Ala，Glu或Asp；第31位的Xaa是Trp 第32位的Xaa是Leu 第33位的Xaa是Val 第34位的Xaa是Asn 第35位的Xaa是Gly 第36位的Xaa是Gly 第37位的Xaa是Pro 第38位的Xaa是Ser 第39位的Xaa是Ser 第40位的Xaa是Gly 第41位的Xaa是Ala 第42位的Xaa是Ser 第43位的Xaa是Ser 第44位的Xaa是Gly 第45位的Xaa是Ala 前提是当第37，38，39，40，41，42，43或44位的氨基酸被去除时，该氨基酸下游的所有 氨基酸也被去除，第二个多肽是人白蛋白，其中第一个多肽的C末端通过肽接头与第二个多肽的N末端 融合。3. 如权利要求2所述的异源融合蛋白，其中所述的肽接头是具有序列 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n是l'2，3，4，5或6。4. 权利要求1-3中任一项所述的异源融合蛋白，其中，GLP-1化合物具有不超过6个不 同于GLP-1 (7-37) 0H， GLP-1 (7-36) 0H或Exendin-4中的相应氨基酸的氨基酸。5. 权利要求4的异源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超过5个不同于GLP-1 (7-37) 0H， GLP-1 (7-36) 0H或Exendin-4中的相应氨基酸的氨基酸。6. 权利要求5的异源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超过4个不同于GLP-1 (7-37) 0H， GLP-1 (7-36) 0H或Exendin-4中的相应氨基酸的氨基酸。7. 权利要求6的异源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超过3个不同于GLP-1 (7-37) 0H， GLP-1 (7-36) 0H或Exendin-4中的相应氨基酸的氨基酸。8. 权利要求7的异源融合蛋白，其中GLP-1化合物具有不超过2个不同于GLP-1 (7-37) 0H， GLP-1 (7-36) 0H或Exendin-4中的相应氨基酸的氨基酸。9. 一种异源融合蛋白，其具有第一个多肽，该多肽具有N末端和与具有N末端和C末端 的第二个多肽融合的C末端，其中第一个多肽是具有式I，即SEQ ID N0:2所示序列的GLP-1 化合物789 10 11 12 13 14 15 16 17 His_Xaa_Xaa_Gly_Xaa_Phe_Thr_Xaa_Asp_Xaa_Xaa_ 18 19 20 21 22...

【专利技术属性】
技术研发人员：W格莱斯纳，R米卡诺维克，张盛虹，
申请(专利权)人：伊莱利利公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]