【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其是涉及一种基于taqman探针法的多重实时荧光定量pcr技术快速检测鳗鲡肠毒性及溶血性气单胞菌。
技术介绍
1、鳗鲡(anguilla spp)是我国重要的名贵经济鱼类，目前已形成集养殖、饲料生产、产品加工与出口等较为成熟的产业链。然而，在高密度集约化的鳗鲡养殖过程中，由气单胞菌引起的鳗鲡出血性败血症、肠炎、赤皮、溃疡等疾病时有发生，对鳗鲡产业危害严重，并造成巨大经济损失。研究表明，鳗鲡致病性气单胞菌的种类繁多，主要有嗜水气单胞(aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(a.veroni)、豚鼠气单胞菌(a.caviae)、温和气单胞菌(a.sobria)等。在养殖过程中发现，同种气单胞菌的不同菌株感染鳗鲡后，鳗鲡病症表现不同；相反，不同种气单胞菌感染鳗鲡后，有时却表现出相似的症状。这主要是因为不同气单胞菌所携带的毒力因子的种类和数量不同，导致其致病力强弱、临床症状以及其所造成的经济损失等也明显不同。携带毒力因子的气单胞菌还可通过水产动物和水产品的介导，引起人畜腹泻和食物中毒。为此，建立快速、便捷、高效的致病性气单胞菌的方法，不仅有利于鳗鲡气单胞菌病的正确诊断和制定科学防控方案；同时，对于保障水产品安全也具有重要的意义。
2、气单胞菌的毒力因子众多，包括外毒素、胞外蛋白质酶、结构蛋白质、分泌相关和信号传导蛋白质等。其中，被证实可引起宿主病灶部位溶血、出血、肠炎等疾病症状的毒力因子主要是外毒素中的细胞毒性肠毒素(cytotoxic enterotoxin，编码基因为act，下同)
3、随着分子生物学检测技术发展，普通pcr技术由于易引起实验室污染，无法定量等缺点，正在逐步被qpcr所取代。王海波等(2009)、王蓉等(2012)和余波等(2014)以hlya为靶基因分别建立基于sybr green i和taqman探针的单重qpcr体系定量检测样本中的嗜水气单胞菌(王海波,王多春,毕振强,等.嗜水气单胞菌taqman实时pcr检测方法的建立.中华预防医学杂志.2009,43(7):611-614；王蓉,王忠发,王志铮,等.实时荧光定量pcr快速检测嗜水气单胞菌方法的建立.现代预防医学.2012,39(13):3339-3341；余波,罗永成,马永兵,等.大鲵致病性嗜水气单胞菌sybr green i荧光定量pcr诊断试剂盒的研制.基因组学与应用生物学,2014,33(5):1098-1103)；yu at al(2011)则以alt为靶基因建立基于sybrgreen i的单重qpcr体系检测水体中嗜水气单胞菌；trakhna et al(2009)和高智玲等(2016)均以act和16s rdna为靶基因建立基于taqman探针的双重qpcr技术，应用于致病性嗜水气单胞菌感染的诊断、疾病防控及流行病学研究(高智玲,纪雪,郭学军,等.嗜水气单胞菌双重荧光定量pcr检测方法的建立与初步应用.中国人兽共患病学报,2016,32(12):1126-1130)；孟双等(2012)则以aera、丝氨酸蛋白酶基因(ahp)和16srdna为靶基因建立基于taqman探针的三重qpcr技术，快速检测人类临床样本中的嗜水气单胞菌(孟双,白雪梅,王艳,等.嗜水气单胞菌实时荧光三重taqman pcr快速检测体系的建立.中国人兽共患病学报,2012,28(3):217-222.)。
4、综上，目前建立的单重和多重qpcr快速检测技术主要集中在嗜水气单胞菌，尚未建立其它致病性气单胞菌的快速检测；检测的毒力基因也尚未覆盖导致宿主肠毒性和溶血性的所有外毒素毒力基因；同时，进一步分析我国和国际专利数据库，尚未发现有关快速检测鳗鲡肠毒性及溶血性气单胞菌的多重qpcr的检测技术及试剂盒等相关技术专利。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供多重实时荧光定量pcr技术快速检测鳗鲡肠毒性及溶血性气单胞菌的引物探针组合，包括双重(act+ast、alt+hly)和三重(act+ast+alt)，可快速检测致病性气单胞菌溶血相关的肠毒素基因(act、ast、alt)及溶血素基因(hly)，特异性好。
2、本专利技术的另一目的在于提供基于taqman探针的双重和三重实时荧光定量pcr检测方法，采用所述引物探针组合，检测方法快速简便，准确性高，灵敏度高。
3、本专利技术是这样实现的：
4、本专利技术提供同时检测鳗鲡肠毒性及溶血性气单胞菌的引物和探针组合，基于taqman探针的双重act+ast、alt+hly和三重act+ast+alt实时荧光定量pcr引物探针组合，可检测致病性气单胞菌的四个毒力基因，即细胞毒性肠毒素(act)、耐热细胞肠毒素(ast)、不耐热细胞肠毒素(alt)和溶血素(hly)；
5、所述引物探针组合包括由细胞毒性肠毒素(act)、耐热细胞肠毒素(ast)、不耐热细胞肠毒素(alt)和溶血素(hly)的正向引物(f)、反向引物(r)及探针引物(p)等12条组成，如序列表seq id no.1～12所示，相应序列具体如下：
6、act-qf：5’-ggccgatgtcagctatgacc-3’
7、act-qr：5’-ctcgccttgtccttgtacgg-3’
8、act-qp：5’-fam-accgcccgaactggaaccacacctt-bhq1-3’
9、ast-qf：5’-tggatcacctaccgggatgc-3’
10、ast-qr：5’-gtgactgccgatccagatgc-3’
11、ast-qp：5’-vic-ccgctcaactccttgatgctgcacgga-bhq1-3’
12、alt-qf：5’-ccaaggatgccctcaacacc-3’
13、alt-qr：5’-cagcgcataggcgttctctt-3’
14、alt-qp：5’-rox-tctatcagcacggcgtcacctcggtga-bhq2-3’
15、hly-qf：5’-gcaagatcagcgatgccgag-3’
16、hly-qr：5’-tgacccggtaaaccagcgag-3’
17、hly-qp：5’-vic-accggctgttctgcgattcgccgaa-bhq1-3’
18、其中，fam、vi本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.同时检测鳗鲡肠毒性及溶血性气单胞菌的引物和探针组合，其特征在于所述引物和探针组合包括由细胞毒性肠毒素act、耐热细胞肠毒素ast、不耐热细胞肠毒素alt和溶血素hly的正向引物F、反向引物R及探针引物P共12条组成，如序列表SEQ ID NO.1～12所示，相应序列具体如下：
2.同时检测鳗鲡肠毒性及溶血性气单胞菌相关毒力基因的多重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所述引物和探针组合。
3.如权利要求2所述同时检测鳗鲡肠毒性及溶血性气单胞菌相关毒力基因的多重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于其用于检测致病性气单胞菌溶血相关的肠毒素基因act、ast、alt及溶血素基因hly四种毒力基因的检测；包括双重PCR检测试剂盒和三重PCR检测试剂盒；
4.基于Taqman探针的双重和三重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：
5.如权利要求4所述基于Taqman探针的双重和三重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述设计基于TaqMan探针的qPCR引物探针组合，具体步骤为：
7.如权利要求6所述基于Taqman探针的双重和三重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述双重act+ast、alt+hly和三重act+ast+alt实时荧光定量PCR的反应体系：20μL反应体系：2×TaqMan qPCR buffer 10.0μL，引物10μmol/L为0.1～0.8μL，探针10μmol/L为0.1～0.4μL，模板1.0μL，用ddH2O补充至20.0μL。
8.如权利要求4所述基于Taqman探针的双重和三重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述进行双重act+ast、alt+hly和三重act+ast+alt实时荧光定量PCR扩增反应的程序采用2步法：预变性95℃3～15min，95℃15～60s，退火温度58～62℃，退火时间10～60s，并收集荧光信号，设置40个循环。
9.如权利要求4所述基于Taqman探针的双重和三重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于在步骤4)中，根据双重act+ast、alt+hly和三重act+ast+alt实时荧光定量PCR扩增结果，进行定量或定性分析判断，具体分析判断的标准如下：
10.如权利要求1所述引物和探针组合在制备荧光定量PCR试剂盒中的应用，所述试剂盒用于定量检测样本中致病性气单胞菌的细胞毒性肠毒素act、耐热细胞肠毒素ast、不耐热细胞肠毒素alt和溶血素hly；在检测疑似鳗鲡致病性气单胞菌感染样品或多种病原混合感染中的应用；
...【技术特征摘要】
1.同时检测鳗鲡肠毒性及溶血性气单胞菌的引物和探针组合，其特征在于所述引物和探针组合包括由细胞毒性肠毒素act、耐热细胞肠毒素ast、不耐热细胞肠毒素alt和溶血素hly的正向引物f、反向引物r及探针引物p共12条组成，如序列表seq id no.1～12所示，相应序列具体如下：
2.同时检测鳗鲡肠毒性及溶血性气单胞菌相关毒力基因的多重实时荧光定量pcr试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所述引物和探针组合。
3.如权利要求2所述同时检测鳗鲡肠毒性及溶血性气单胞菌相关毒力基因的多重实时荧光定量pcr试剂盒，其特征在于其用于检测致病性气单胞菌溶血相关的肠毒素基因act、ast、alt及溶血素基因hly四种毒力基因的检测；包括双重pcr检测试剂盒和三重pcr检测试剂盒；
4.基于taqman探针的双重和三重实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于包括以下步骤：
5.如权利要求4所述基于taqman探针的双重和三重实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述设计基于taqman探针的qpcr引物探针组合，具体步骤为：
6.如权利要求4所述基于taqman探针的双重和三重实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述双重act+ast、alt+hly和三重act+ast+alt实时荧光定量pcr的反应体系：体积15～50μl，引物与探针浓度比为1︰1～5︰1；引物浓度为10μmol/l，体积为0.1～0.8μl；探针浓度为10μmol/l，...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊静，黄文树，黄艺馨，邓睿，李林益，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：
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