【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于产生肝细胞的方法、通过这些方法产生的肝细胞以及这些肝细胞的用途和应用。
技术介绍
1、肝细胞是肝脏的主要细胞类型，占肝脏体积的80％，并且发挥多种重要功能，包括脂质代谢、常量营养素的储存、血浆蛋白的分泌和异生素解毒(gordillo等人,2015；si-tayeb等人,2010；trefts等人,2017)。
2、影响这些功能的疾病会危及生命，末期形式需要肝移植。然而，由于供体的缺乏和免疫抑制的副作用，只有有限数量的患者可以从这种疗法中受益。
3、已经发现使用原代肝细胞的基于细胞的疗法是整个器官移植的有吸引力的治疗替代方案(dhawan等人,2020)。然而，原代人肝细胞(phh)供应短缺，因为它们只能从不适合移植的次优肝脏中获得。此外，它们在体外表现出寿命短、无增殖和功能的快速丧失(mitry等人,2002)。同样，缺乏肝细胞的可靠来源也极大地影响了用于药物开发和毒理学筛选的新平台的开发。由于所有这些原因，迫切需要肝细胞的替代性来源。
4、使用定向分化方案从人多能干细胞(hpsc)产生肝细胞已被证明是phh的有利替代方案(palakkan等人,2017；szkolnicka和hay,2016；silier等人2015；hay等人2008)。这些方案通常遵循体外肝脏发育的关键阶段，并允许产生肝细胞样细胞(hlc)，这些肝细胞样细胞表现出关键的肝功能，包括白蛋白分泌、脂质代谢、糖原贮积和尿素循环活性。然而，hlc系统地呈现出缺乏成熟肝细胞的全部功能的未成熟/胎儿样表型(baxt
5、作为替代方案，已经探索了转录因子的过表达作为改善体外生成的肝细胞功能的方法(boon等人,2020；nakamori等人,2016；zhao等人,2013)。此外，通过在小鼠和人成纤维细胞中过表达肝脏富集的转录因子(letf)，已经实现了体细胞向肝细胞的转分化(rombaut等人,2021)。重要的是，这些letf包含hnf1、hnf3(foxa)、hnf4和hnf6(onecut)家族，所有这些家族在协调肝脏发育中起关键作用(gordillo等人,2015；lau等人,2018；schrem等人,2002)。然而，由于在完全分化的细胞中存在强烈的表观遗传限制，从体细胞类型进行直接细胞转化的效率/产率较低。此外，体细胞具有有限的增殖能力，这限制了在不使用致癌操作的情况下肝细胞的大规模生产(du等人,2014；huang等人,2014)。
技术实现思路
1、本专利技术诸位专利技术人开发了用于通过正向程序化人多能细胞产生功能上成熟的肝细胞(本文称为fop-hep)的方法。例如，这可用于功能性肝细胞的有效产生，例如用于在肝障碍的建模；以及肝障碍的疗法的开发中使用。
2、本专利技术的第一方面提供了产生肝细胞的方法，该方法包括：
3、(i)提供ipsc群体
4、(ii)将一组由hnf1a、hnf6、foxa3、rorc和erα组成的转录因子引入该ipsc群体，以及
5、(iii)培养该群体，从而产生肝细胞。
6、本专利技术的第二方面提供了将ipsc正向程序化为肝细胞的方法，该方法包括：
7、将一组由hnf1a、hnf6、foxa3、rorc和erα组成的转录因子引入ipsc群体，以及
8、培养该群体，从而产生肝细胞。
9、本专利技术的第三方面提供了产生肝细胞的方法，该方法包括：
10、(i)提供ipsc群体
11、(ii)将一组由hnf1a、hnf6、foxa3、和rorc组成的转录因子引入该ipsc群体，以及
12、(iii)培养该群体，从而产生肝细胞。
13、本专利技术的第四方面提供了将ipsc正向程序化为肝细胞的方法，该方法包括：
14、将一组由hnf1a、hnf6、foxa3、和rorc组成的转录因子引入ipsc群体，以及
15、培养该群体，从而产生肝细胞。
16、本专利技术的第五方面提供了一种肝细胞群体，其通过根据第一、第二、第三或第四方面所述的方法产生。
17、本专利技术的第六方面提供了一种药物组合物，其包含根据第五方面所述的肝细胞群体和药学上可接受的赋形剂。
18、本专利技术的第七方面提供了根据第五方面所述的肝细胞群体，用于在治疗人体或动物体的方法中使用，例如用于在治疗个体的肝障碍的方法中使用。
19、本专利技术的第八方面提供了治疗肝障碍的方法，该方法包括：
20、向有需要的个体施用根据第五方面所述的肝细胞群体。
21、本专利技术的第九方面提供了根据第五方面所述的肝细胞群体在制造用于在治疗肝障碍中使用的药剂中的用途。
22、本专利技术的第十方面提供了筛选可用于治疗肝障碍的化合物的方法，该方法包括：
23、使根据第五方面所述的肝细胞群体与测试化合物接触，以及
24、确定该测试化合物对所述肝细胞的作用或这些肝细胞对该测试化合物的作用。
25、在一些实施例中，用于在第十方面所述的方法中使用的肝细胞可以具有疾病表型，如肝障碍表型。
26、本专利技术的第十一方面提供了确定化合物的肝毒性的方法，该方法包括：
27、使根据第五方面所述的分离的肝细胞与测试化合物接触，以及
28、确定该测试化合物对所述肝细胞的作用。
29、本专利技术的第十二方面提供了鉴定促进肝细胞成熟的转录因子的方法，该方法包括：
30、确定一组转录因子在原代人肝细胞(phh)和通过体外定向分化产生的肝细胞样细胞(hlc)中的表达，
31、鉴定该组中相对于clc在phh中的表达增加的转录因子，
32、鉴定的转录因子是促进肝细胞成熟的候选转录因子。
33、本专利技术的第十三方面提供了鉴定与肝障碍相关的基因突变的方法，该方法包括：
34、提供第五方面所述的肝细胞的测试群体，其中该测试群体中的肝细胞各自包含基因突变；
35、将该肝细胞的测试群体的表型与肝细胞的对照群体的表型进行比较，其中该对照群体不包含基因突变；以及
36、鉴定该测试群体中表现出疾病表型(如肝障碍表型)的肝细胞，
37、其中鉴定的肝细胞中的基因突变是与肝障碍相关的候选基因突变。
38、本专利技术的第十四方面提供了鉴定与肝障碍相关的基因突变的方法，该方法包括：
39、提供第五方面所述的肝细胞的测试群体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产生肝细胞的方法，该方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中该组转录因子由HNF1A、HNF6、FOXA3、RORc和ERα组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中该组转录因子由HNF1A、HNF6、FOXA3、和RORc组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些肝细胞是功能上成熟的肝细胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中多能干细胞是人多能干细胞(hPSC)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些多能干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些转录因子是人转录因子。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将细胞群体在合适的条件下培养足够的时间段，以使一种或多种细胞表现出肝细胞表型。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)期间，所述细胞群体不表现出内胚层和肝祖细胞表型。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该组转录因子通过以下方式引入PSC
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过用一种或多种载体转染这些PSC，在这些PSC中表达编码该组转录因子的核酸，该一种或多种载体包含与用于在这些PSC中表达这些核酸的一种或多种调节元件可操作地连接的所述核酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其中该一种或多种调节元件是诱导型调节元件。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中这些载体是慢病毒载体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将PSC群体培养至少7天。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)之后，至少5％的所述群体被正向程序化为肝细胞。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括分离和/或纯化肝细胞。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括扩大肝细胞群体。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括储存该肝细胞群体。
19.一种肝细胞群体，其通过根据前述权利要求中任一项所述的方法产生。
20.一种药物组合物，其包含根据权利要求19所述的肝细胞群体和药学上可接受的赋形剂。
21.根据权利要求19所述的肝细胞群体，用于在治疗人体或动物体的方法中使用。
22.根据权利要求19所述的肝细胞群体，用于在治疗个体的肝障碍的方法中使用。
23.一种治疗肝障碍的方法，该方法包括：
24.根据权利要求19所述的肝细胞群体在制造用于在治疗肝障碍中使用的药剂中的用途。
25.一组由HNF1A、HNF6、FOXA3、RORc和任选的Erα组成的转录因子；或编码该组转录因子的一种或多种核酸用于产生肝细胞的用途。
26.一种筛选可用于治疗肝障碍的化合物的方法，该方法包括：
27.一种确定化合物的肝毒性的方法，该方法包括：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种产生肝细胞的方法，该方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中该组转录因子由hnf1a、hnf6、foxa3、rorc和erα组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中该组转录因子由hnf1a、hnf6、foxa3、和rorc组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些肝细胞是功能上成熟的肝细胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中多能干细胞是人多能干细胞(hpsc)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些多能干细胞是诱导多能干细胞(ipsc)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些转录因子是人转录因子。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将细胞群体在合适的条件下培养足够的时间段，以使一种或多种细胞表现出肝细胞表型。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)期间，所述细胞群体不表现出内胚层和肝祖细胞表型。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该组转录因子通过以下方式引入psc：
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过用一种或多种载体转染这些psc，在这些psc中表达编码该组转录因子的核酸，该一种或多种载体包含与用于在这些psc中表达这些核酸的一种或多种调节元件可操作地连接的所述核酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其中该一种或多种调节元件是诱导型调节元件。
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【专利技术属性】
技术研发人员：L·瓦里尔，R·A·德科斯塔托马斯，
申请(专利权)人：剑桥企业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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