【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过连接抗体中某些半胱氨酸位点的硫基制备均一的抗体偶联物或类抗体蛋白分子/试剂的偶联物的方法。本专利技术还涉及以特定方式制备偶联物的方法，包括生成抗体或类抗体蛋白试剂的特异性巯基，然后与药物/连接子复合物反应，或生成抗体或类抗体蛋白质试剂的特异性巯基，同时在一锅中与合成制备的连接子-药物组装体反应。它还涉及均一偶联物在靶向预防或治疗癌症、感染和免疫疾病的方法。
技术介绍
0、技术背景
1、如今，adc的发展步伐正在加快，过去5年的临床试验数量增加了三倍多，12个上市adc中有7个在过去2年中，获得了美国fda的批准，凸显了对这种变革性癌症治疗方法的热情。通过连接子将有效载荷和抗体偶联是决定adc质量、安全性、疗效和整体成功的关键方面(m.acchione、h.kwon等人，2012，mabs 4：3，362-372；m.j.birrer，k.n.moore等人，2019，j.national cancer inst.，111(6)，538-549)。美国fda发布的一份报告指出，对于目前处于临床开发阶段的大多数adc，剂量限制性毒性(dlt)似乎与靶向抗原无关，而是由有效载荷/连接子复合物有关(h.saber和j.k.leighton，regulatory toxicology andpharmacology 71(2015)444–452)；众所周知，adc的连接子和偶联位点对adc在制备和储存过程中的稳定性，以及体内血液循环中的毒性强弱，也起重要作用(j.r.mccombs和s.c.owen，201
2、因此，现在对adc化学和设计的研究和发展方向之一就是扩展连接子-有效载荷和偶联化学，以解决adc对目标疾病的剂量限制性毒性(dlt)问题(lambert，j.m.2016，ther.deliv.7，279-82；zhao，r.y.等人，2011，j.med.chem.54，3606-23)。目前，为扩展adc治疗窗口(tw)，主要的研发工作集中在开发新型的可靠的定点adc偶联方法，获得的adc似乎具有循环半衰期更长，疗效更高，更能降低脱靶毒性，更优的体内药代动力学(pk)，生产工艺批间一致性更好等特性(hussain，a.f.，等，pharmaceuticals(basel)，2021，14(4)，343；sadiki，a.，等，antib ther.2020，3(4)，271-284；wolska-washer，a.；robak，t.，drugsaf，2019，42(2)，295-314；tsuchikama，k.，an，z.，protein cell.2018，9(1)，33-46；thomas，a.等，lancet oncol.2016，17(6)，e254-e262；strop，p.，等2013chem.biol.20，161-67；wakankar，a.mabs，2011，3，161–172；zhao，r.y.等，2011，j.med.chem.54，3606-23)。
3、近年来开发了几种用于定点偶联制备adc的方法，(panowski，s，2014，mabs6，34)。它们包括在抗体上引入未配对的半胱氨酸，例如经改造的反应性半胱氨酸残基，即genentech的thiomab技术(junutula，j.r.，等2010clin.cancer res.16，4769；junutula，j.r.，等2008nat biotechnol.26，925-32；美国专利8，309，300；7，855，275；7，521，541；7，723，485，wo2008/141044)，用茂原链轮丝菌转谷氨酰胺酶引入谷氨酰胺标签(mtg)(strop，p.，bioconjugate chem.，2014，25，855–862；strop，p.，等.，2013，chem.biol.20，161–167；美国专利8，871，908，专利权人rinat-pfizer)或是用微生物转谷氨酰胺酶(mtgase)引入(dennler，p.，等，2014，bioconjug.chem.25，569–578.美国专利申请20130189287innatepharma；美国专利7，893，019bio-ker s.r.l.(it))，引入硫代海藻糖(okeley，n.m.，等2013bioconjugate chem.24，1650)，通过诱变引入非天然氨基酸(axup，j.y.，等，2012，proc.natl.acad.sci.109，16101–16106；zimmerman，e.s.，等，2014，bioconjug.chem.25，351–361；wu，p.，等，2009proc.natl.acad.sci.106，3000-5；rabuka，d.，等，2012nat.protoc.7，1052-67；美国专利8，778，631和美国专利申请20100184135，wo2010/081110，申请人sutro biopharma；wo2006/069246，2007/059312，美国专利7，332，571，7，696，312，和7，638，299，专利权人，ambrx；wo2007/130453，美国专利7，632，492和7，829，659，专利权人allozyne)，引入硒代半胱氨酸(hofer，t.，等2009，biochemistry 48，12047–12057；美国专利8，916，159，专利权人us national cancer institute)，使用甲酰甘氨酸生成酶(fge)将位于cxpxr共有序列中的半胱氨酸转化为甲酰甘氨酸(fgly)(drake，p.m.，等，2014，bioconjug.chem.25，1331–1341；carrico，i.s.等7，985，783；8，097，701；8，349，910，和美国专利申请20140141025，20100210543，申请人redwood bioscience)；使用半乳糖基和唾液酸转移酶通，过糖工程引入唾液酸(zhou，q.，等2014，bioconjug.chem.，25，510-520，美国专利申请20140294867，申请人sanofi-genzyme)；引入赖氨酸的环丙烯衍生物，然后与四嗪衍生物进行diels-alder环加成反应，产生1，4-二氢哒嗪(oller-salvia，b.等，2018angew chem int ed engl，57，2831-2834)。
4、然而，上述方法均需要对抗体进行工程改造和重新优化细胞培养条件，通常还有蛋白表达低、偶联产量低或偶联位点有限等问题。因此，研究者开发了通过重新桥接天然抗体链间二硫键的简单的均一偶联方法，例如使用溴或二溴马来酰亚胺连接子(下一代马来酰亚胺，ngm)(schumacher，f.f.，等2014，org.biomol.chem.12，7261–69；ucl cancerinstitute)，或使用二溴嘧啶二酮(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.均一偶联的过程包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的过渡金属阳离子氨基螯合物，选自Zn(NH2CH3)22+、Zn(NH2CH2CH3)22+、Zn(NH2CH2CH2CH3)22+、Zn(NH2CH(CH3)2)22+、Zn(NH2C(CH3)3)22+、Zn(NH2CH2C(CH3)3)22+、Zn(NH(CH3)2)22+、Zn(NH(CH2CH3)2)22+、Zn(NH(CH(CH3)2)2)22+、Zn(NH(C(CH3)3)2)22+、Zn(NH(CH(CH2CH3)2)2)22+、Zn(NH(CH2C(CH3)3)2)22+、Zn(NH(CH2C(CH2CH3)3)2)22+、Zn(NH(CH2CH2C(CH3)3)2)22+、Zn(NH2CH2CH2OH)22+、Zn(NH(CH2CH2OH)2)22+、Zn(N(CH2CH2OH)3)22+、Zn(NH2CH2COOH)22+、Zn(NH2CH2CONH2)22+、Zn(NH2CH2COOCH3)22+、Zn(NH2CH2COOCH2CH3)22+、Zn(NH2CH2COOC(CH3)3)22+
3.根据权利要求所述1的方法，其中有机膦还原剂选自三(羟丙基)-膦(P(CH2CH2CH2OH)3)、P(CH2CH3)3、P(CH2CH2CH3)3、P(CH2CH2-CH2CH3)3、P(CH(CH3)2)3、P(CH2CH＝CH2)3、P(CH2CH2CN)3、P(CH(CH3)2)2(CH2CH2NH2)、P(CH2CH2CONH2)3、P(CH2CH2CONHCH3)3、P(CH2CH2CH2NHCOCH3)3、NaB(CN)H3、(C6H11)2P(CH2)4P(C6H11)2、(C6H11)2P(CH2)3P-(C6H11)2、二环己基(乙基)膦、双[2-(二叔丁基膦基)乙基]胺、三环己基膦、1，2-乙二基双[二环己基]-膦、双[2-(二环己基膦基)乙基]胺、三[2-(二苯基膦基)乙基]-膦([(C6H5)2PCH2CH2]3P)、三苯基膦、磺酰化三苯基膦(2-(二苯基膦基)苯磺酸(diPPBS)、3-(二苯基膦基)苯磺酸、4-(二苯基膦基)苯磺酸、3，3′，3″-膦三基三苯磺酸)；优选地，还原剂选自TECP或P(CH2CH2CH2OH)3，更优选地，该还原剂选自TECP。且步骤(A)的反应溶液中使用的还原剂是2.0-4.0蛋白质摩尔当量当量。反应溶液中使用的还原剂浓度为0.02mM-1.0mM，或反应中使用的蛋白质摩尔数为1.0-20.0。
4.根据权利要求1所述的用于进行选择性还原的最佳缓冲剂选自PBS、Mes、Bis-Tris、Bis-Tris Propane、Pipes、Aces、Mopso、Bes、Mops、Hepes、Tes、Pipps、Dipso、Tapso、Heppso、Tris-up、Tris-HCl、Tricine、Hepps、Gly-Gly、Bicine、Taps、Hepee、Acetate、Histidine、Citrate、MES、Borate，或上述两种、三种或四种缓冲液组分的组合；缓冲液的pH为4.0-9.0；步骤(A)反应中缓冲液的浓度为0.02-1...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.均一偶联的过程包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的过渡金属阳离子氨基螯合物，选自zn(nh2ch3)22+、zn(nh2ch2ch3)22+、zn(nh2ch2ch2ch3)22+、zn(nh2ch(ch3)2)22+、zn(nh2c(ch3)3)22+、zn(nh2ch2c(ch3)3)22+、zn(nh(ch3)2)22+、zn(nh(ch2ch3)2)22+、zn(nh(ch(ch3)2)2)22+、zn(nh(c(ch3)3)2)22+、zn(nh(ch(ch2ch3)2)2)22+、zn(nh(ch2c(ch3)3)2)22+、zn(nh(ch2c(ch2ch3)3)2)22+、zn(nh(ch2ch2c(ch3)3)2)22+、zn(nh2ch2ch2oh)22+、zn(nh(ch2ch2oh)2)22+、zn(n(ch2ch2oh)3)22+、zn(nh2ch2cooh)22+、zn(nh2ch2conh2)22+、zn(nh2ch2cooch3)22+、zn(nh2ch2cooch2ch3)22+、zn(nh2ch2cooc(ch3)3)22+、zn(nh2ch2cooch(ch3)2)22+、zn(nh2ch2ch2cooh)22+、zn(nh(ch2cooh)2)22+、zn(n(ch2ch2cooh)3)22+、zn(nh2ch3)42+、zn(nh2ch2ch3)42+、zn(nh2ch2ch2ch3)42+、zn(nh2ch(ch3)2)42+、zn(nh2c(ch3)3)42+、zn(nh2ch2c(ch3)3)42+、zn(nh(ch3)2)42+、zn(nh(ch2ch3)2)42+、zn(nh(ch(ch3)2)2)42+、zn(nh(c(ch3)3)2)42+、zn(nh(ch(ch2ch3)2)2)42+、zn(nh(ch2c(ch3)3)2)42+、zn(nh(ch2c(ch2ch3)3)2)42+、zn(nh(ch2ch2c(ch3)3)2)42+、zn(nh2ch2ch2oh)42+、zn(nh(ch2ch2oh)2)42+、zn(n(ch2ch2oh)3)42+、zn(nh2ch2cooh)42+、zn(nh2ch2conh2)42+、zn(nh2ch2cooch3)42+、zn(nh2ch2cooch2ch3)42+、zn(nh2ch2cooc(ch3)3)42+、zn(nh2ch2cooch(ch3)2)42+、zn(nh2ch2ch2cooh)42+、zn(nh(ch2cooh)2)42+、zn(n(ch2ch2cooh)3)42+、
3.根据权利要求所述1的方法，其中有机膦还原剂选自三(羟丙基)-膦(p(ch2ch2ch2oh)3)、p(ch2ch3)3、p(ch2ch2ch3)3、p(ch2ch2-ch2ch3)3、p(ch(ch3)2)3、p(ch2ch＝ch2)3、p(ch2ch2cn)3、p(ch(ch3)2)2(ch2ch2nh2)、p(ch2ch2conh2)3、p(ch2ch2conhch3)3、p(ch2ch2ch2nhcoch3)3、nab(cn)h3、(c6h11)2p(ch2)4p(c6h11)2、(c6h11)2p(ch2)3p-(c6h11)2、二环己基(乙基)膦、双[2-(二叔丁基膦基)乙基]胺、三环己基膦、1，2-乙二基双[二环己基]-膦、双[2-(二环己基膦基)乙基]胺、三[2-(二苯基膦基)乙基]-膦([(c6h5)2pch2ch2]3p)、三苯基膦、磺酰化三苯基膦(2-(二苯基膦基)苯磺酸(dippbs)、3-(二苯基膦基)苯磺酸、4-(二苯基膦基)苯磺酸、3，3′，3″-膦三基三苯磺酸)；优选地，还原剂选自tecp或p(ch2ch2ch2oh)3，更优选地，该还原剂选自tecp。且步骤(a)的反应溶液中使用的还原剂是2.0-4.0蛋白质摩尔当量当量。反应溶液中使用的还原剂浓度为0.02mm-1.0mm，或反应中使用的蛋白质摩尔数为1.0-20.0。
4.根据权利要求1所述的用于进行选择性还原的最佳缓冲剂选自pbs、mes、bis-tris、bis-tris propane、pipes、aces、mopso、bes、mops、hepes、tes、pipps、dipso、tapso、heppso、tris-up、tris-hcl、tricine、hepps、gly-gly、bicine、taps、hepee、acetate、histidine、citrate、mes、borate，或上述两种、三种或四种缓冲液组分的组合；缓冲液的ph为4.0-9.0；步骤(a)反应中缓冲液的浓度为0.02-1.0m。缓冲液的ph选择为4.0-9.0，优选5.0-7.5，更优选5.5-7.5。缓冲液在反应中的浓度为0.02-1.0m，优选为20-100mm；并且可以在基于水的缓冲溶液中添加高达30％的水可混合(混溶)的有机溶剂作为共溶剂，所述有机溶剂选自dma、dmf、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、thf、异丙醇、二恶烷、丙二醇或乙二醇。
5.根据，其中所述药物/连接子复合物结构式表示为(i)、(ii)或(iii)：
6.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中产生的抗体或类抗体蛋白中的硫醇基团同时或顺序地与式(i)、(ii)或(iii)的药物/连接子复合物独立地反应，形成如下所示式(v)、(vi)或(vii)的偶联物：
7.根据所述的方法，其中根据权利要求1所属的方法中产生的抗体或类抗体蛋白中的巯基与如下所示的具有结构式(viii)，(ix)或(x)的缩合化合物同时或依次地反应，并独立地与药物，d1和/或d2，形成式(v)，(vi)或(vii)的偶联物：
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或类抗体蛋白中的巯基同时或依次独立地与式(viii)、(ix)或(x)如权利要求7中所示的反应，形成下文所示的式(xi)、(xii)或(xiii)，然后独立地与药物d1或d2反应，形成式(v)、(vi)或(vii)的偶联物：
9.根据权利要求6，7和8所述的方法，其中药物d1和d2发色分子可以吸收紫外光，荧光，红外光，近红外光或可见光；发色分子包括黄色素，红细胞，虹彩色素，白细胞，黑色素和蓝绿色素的一类或一个亚类；荧光分子的一类或一个亚类，其是一种荧光化学物质；视觉光转导分子的一类或一个亚类；光子分子的一类或一个亚类，冷光分子的一类或一个亚类或荧光素化合物的一类或一个亚类；因此，偶联物可用于检测、监测或研究细胞结合分子与靶细胞的相互作用
10.所述药物d1和d2独立地为聚亚烷基二醇选自聚乙二醇(peg)、聚丙二醇和环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物；特别优选的是peg，更特别优选的是单功能活化的羟基peg(例如，在单末端活化的羟基peg，包括羟基peg单羧酸、羟基peg单醛、羟基peg单胺类、羟基peg双酰肼、羟基peg一卡巴肼、羟基聚乙二醇一碘乙酰胺、羟基peg二马来酰亚胺、羟基peg正吡啶二硫化物、羟基peg肟、羟基peg碳酸单苯酯、羟基peg苯基乙二醛、羟基-peg-单噻唑烷-2-硫酮、羟基-peg单硫酯、羟基-ppeg单硫醇、羟基-peg-单三嗪和羟基-peg-单乙烯基砜)。聚亚烷基二醇的分子量为约10道尔顿至约200kda及其偶联物可用于延长抗体或抗体样蛋白质分子在给药于哺乳动物时的半衰期。
11.根据权利要求6，7和8药物d1和d2选自：
12.根据权利要求1，6或8所述的抗体或类抗体蛋白选自：
13.根据权利要求6所述的偶联物，其中超过75％的药物特异性偶联到抗体的重轻链之间的二硫键位点，所述偶联物具有以下结构a001-a233、c-009、c-020、c-025、c-027、c-031、c-037、c-038、c-039、c-043、c-046、c-052、c-056、c-059、c-063、c-066、c-...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·赵，杨庆良，刘晓磊，张龄莉，黄圆圆，李雯君，叶杭波，王娟，郭辉辉，周游，
申请(专利权)人：杭州多禧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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