【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒p14.5蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用。本专利技术属于动物病毒学和动物基因工程。
技术介绍
1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)引起的一种急热性、高度接触性病毒传染病。根据临床症状的不同表现可以将asf划分为四种，分别是最急性、急性、亚急性及隐性型。asfv可感染家猪及野猪，被感染动物死亡率高达100％。2018年我国首次报道asf病例，至今已遍布全国各省，造成巨大经济损失。
2、非洲猪瘟病毒为双链dna病毒，基因组170-190kb，可编码68种结构蛋白和100多种非结构蛋白，其中p14.5蛋白又称为pe120r蛋白，是由e120r基因编码的病毒结构蛋白。非洲猪瘟病毒由包膜、衣壳、内囊膜、核壳及内核组成，是非洲猪瘟病毒属的唯一成员。病毒粒子为200nm的二十面体，组装在内膜上，围绕着核蛋白核心。
3、自asfv首次被报道起，针对asfv的疫苗研制工作就已经开始进行。研究人员开发了各种疫苗技术，灭活病毒、减毒活疫苗、重组蛋白/肽和dna疫苗等，但迄今为止，仍无一种有效、安全的asf病毒疫苗面世。研究表明，接种asfv灭活疫苗后无论是对同源还是异源的活病毒，都不能起到保护作用。而且灭活的asfv即使在存在各种佐剂的情况下也不能提供保护。argilaguet等制备的dna疫苗，是将asfvp72、p30和p54基因克隆入真核表达载体，但发现该疫苗免疫猪后没有诱导保护作用。p>
4、在众多新型疫苗生产技术中纳米颗粒疫苗由于其优势显著，备受人们青睐。利用天然蛋白质开发出的纳米笼结构具有更高的稳定性，在生物医学如疫苗、药物递送等方面应用广泛，发展前景广阔。纳米颗粒疫苗由于将抗原附着在较大的支架上，提高了apc在淋巴滤泡中的摄取和保留。其可使抗原重复阵列，使多个b细胞受体能够有效地结合和激活。从而更好的激活机体特异性免疫反应，从而起到同灭活苗和弱毒苗相同的保护作用，同时由于纳米抗原不含有遗传物质，所以不存在感染，突变等安全隐患。另外，纳米颗粒具有良好的稳定性且易于生产。
5、通过对现有技术进行讨论和分析，目前的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗、核酸疫苗和病毒活载体疫苗的保护效力偏低。因此需要进一步研究非洲猪瘟病毒蛋白免疫原性，并利用新技术和新方法构建出安全有效的asf疫苗。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒p14.5蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
3、本专利技术将骨架蛋白与非洲猪瘟病毒的p14.5抗原进行融合表达，在毕赤酵母表达系统中表达，镍柱亲和层析纯化后经组装缓冲液的诱导，能够自发地形成蛋白纳米颗粒。通过在小鼠体内进行免疫原性测定，所制备的p14.5蛋白纳米颗粒能引起很强的免疫反应，极有潜力开发成为新的安全有效的非洲猪瘟病毒疫苗。
4、为此，第一方面，本专利技术提供一种非洲猪瘟病毒p14.5蛋白纳米颗粒，所述蛋白纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体由非洲猪瘟病毒抗原蛋白p14.5和骨架蛋白通过连接肽连接后得到。
5、其中，优选的，所述蛋白纳米颗粒由所述蛋白质单体经组装缓冲液诱导而自组装形成，所述组装缓冲液为含有300mm nacl的40mm tris-hcl溶液，ph 8.0。
6、其中，优选的，所述骨架蛋白为mi3，其编码核苷酸序列为seq id no：1所示。
7、mi3是基于高温噬热菌2-酮-3-脱氧-磷酸葡萄糖酸盐途径中醛缩酶所设计的。可自组装形成正二十面体的六十聚体。与病毒粒子类似，抗原可以高度免疫原性的方式传递给免疫系统。抗原被呈递至淋巴结，再由树突状细胞和高度重复的抗原表面促进b细胞的活化。
8、其中，优选的，所述连接肽可独立地选自刚性连接肽或柔性连接肽，优选为柔性连接肽。在具体的实施方式中，所述连接肽为(ggs)n，n为整数。
9、其中，优选的，根据非洲猪瘟病毒中国流行株china/2018/anhuixcgq序列信息(genbank登录号：qcs27839.1)，所述p14.5蛋白的编码核苷酸序列为seq id no：2所示。
10、其中，优选的，所述蛋白质单体还包含蛋白标签his。
11、其中，优选的，所述非洲猪瘟病毒p14.5蛋白纳米颗粒的编码核苷酸序列如seq idno：3所示。
12、其中，优选的，所述蛋白质单体是通过利用毕赤酵母表达系统表达获得。
13、另一方面，本专利技术还提供了上述所述的非洲猪瘟病毒p14.5蛋白纳米颗粒在以下方面的应用：
14、(1)制备抗非洲猪瘟病毒特异性抗体中的应用；
15、(2)制备预防由非洲猪瘟病毒引起疾病的药物中的应用。
16、再一方面，本专利技术还提供了上述非洲猪瘟病毒p14.5蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
17、(1)分别对asfvp14.5蛋白和骨架蛋白进行密码子优化，然后将优化后的asfvp14.5蛋白和骨架蛋白通过连接肽进行连接，插入到载体ppink-hc中，得重组质粒ppink-p14.5；
18、(2)将步骤(1)所述重组质粒ppink-p14.5转化至毕赤酵母菌感受态中，得到含有重组质粒ppink-p14.5的重组菌；
19、(3)对步骤(2)所述重组菌进行真核表达，纯化后体外组装，得到p14.5蛋白纳米颗粒。
20、其中，优选的，步骤(1)中本专利技术将连接后形成的重组基因进行双酶切，所述双酶切优选为利用ecor i和kpn i进行。本专利技术优选对所述载体ppink-hc进行相同酶切位点的双酶切，而后分别对酶切产物进行胶回收，将回收的基因片段，利用t4 dna连接酶进行连接，得重组质粒ppink-p14.5。本专利技术对胶双酶切、胶回收和连接的操作和程序并没有特殊限定，利用本领域的常规操作即可。
21、其中，优选的，步骤(2)中本专利技术将步骤(1)所述asfv重组质粒ppink-p14.5转化至毕赤酵母菌感受态中，得重组菌。本专利技术进行转化时，将每80μl的毕赤酵母菌感受态与10μg的asfv重组质粒ppink-p14.5混合。本专利技术采用电转化法将重组质粒导入毕赤酵母感受态中，后诱导表达。
22、其中，优选的，取上述的重组质粒10μg，经线性化后，电转至毕赤酵母感受态细胞中，进行诱导表达，具体步骤如下：
23、本专利技术在电转asfv重组质粒ppink-p14.5入毕赤酵母感受态前需要将质粒线性化，取制备得到的asfv重组质粒ppink-p14.5用内切酶speⅰ进行酶切，酶切体系如下：
24、
25、混匀后，室温顺时离心使液体甩到管底，37℃水浴2h。酶切完成后取2μl，与原质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定线性化结果，经鉴定，质粒已酶切完全本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)P14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体由非洲猪瘟病毒P14.5蛋白和骨架蛋白通过连接肽连接后得到。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白纳米颗粒由所述蛋白质单体经组装缓冲液诱导而自组装形成，所述组装缓冲液为含有300mMNaCl的40mM Tris-HCl溶液，pH 8.0。
3.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述骨架蛋白为mi3，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
4.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述P14.5蛋白的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。
5.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述连接肽选自刚性连接肽或柔性连接肽。
6.如权利要求5所述的非洲猪瘟病毒P14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述连接肽为柔性连接肽，
7.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白质单体还包含蛋白标签His。
8.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒P14.5蛋白纳米颗粒的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
9.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白质单体是通过利用毕赤酵母表达系统表达获得。
10.如权利要求1-9任一项所述的非洲猪瘟病毒P14.5蛋白纳米颗粒在以下方面的应用：
...【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)p14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体由非洲猪瘟病毒p14.5蛋白和骨架蛋白通过连接肽连接后得到。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白纳米颗粒由所述蛋白质单体经组装缓冲液诱导而自组装形成，所述组装缓冲液为含有300mmnacl的40mm tris-hcl溶液，ph 8.0。
3.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述骨架蛋白为mi3，其编码核苷酸序列为seq id no：1所示。
4.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p14.5蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述p14.5蛋白的编码核苷酸序列为seq id no：2所示。
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【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧琛，吴金恩，李林杰，孙世琪，裴辰辰，滕志东，白满元，王运航，张韵，丁耀忠，邵军军，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心，
类型：发明
国别省市：
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