【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种elisa检测试剂盒及其应用，特别涉及一种用于a型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断elisa试剂盒及其应用。本专利技术属于生物。
技术介绍
1、口蹄疫(foot-and-mouth disease，fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，fmdv)引起偶蹄动物(猪、牛、羊等)感染的一类动物传染病。其传播速度快，呈全球分布，对畜牧业的发展影响较大，woah将其列为必须上报的动物疫病，也是我国重点防范、优先防治的一类动物疫病。该病在国家动物疫病防治长期发展规划中被确定为首位限期免疫净化防控的病种。口蹄疫病毒有7个血清型，流行具有明显的地域性，其中a、o两型流行区域最广，我国目前主要以o型为主，近5年a型口蹄疫发病率较低，但仍呈零星散发。目前口蹄疫病毒样颗粒疫苗已作为新型疫苗产品成功获得新兽药证书，而该类疫苗在免疫后是否产生中和抗体以及抗体效价是评价疫苗效果的关键指标。
2、目前，普遍认为fmdv中和抗体检测技术的经典方法是病毒中和实验(virusneutralization test,vnt)，由于中和性抗体能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原侵入细胞，所以病毒中和试验能最直接的反映出疫苗诱导的抗体是否具有保护作用。但与常用的特异性抗体检测方法酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbentassay,elisa)相比，存在费时、费力，工作量大，实验步骤复杂、实验条件要求高、依赖于细胞培养、安全性低，结果易受污染及不易推广等缺点。
3、随着分子生物学技术的发展及抗体研究的不断深入，单域抗体(singledomainantibodie,sdab)的研究已成为实验研究和诊断应用的重要工具与制剂，单域抗体在调节免疫功能，中和毒素和抗微生物感染等方面具有广阔的应用前景。其中，中和性单域抗体可以识别抗原上的中和表位，利用这一特点，结合液相阻断elisa，就可以检测血清是否具有中和病毒的活性，从而计算出中和抗体滴度。
4、目前，尚未有商品化的检测中和抗体的elisa试剂盒。因此，本专利技术基于自主研发制备的a型口蹄疫病毒中和抗体ab1抗体和a型口蹄疫病毒vlps抗原，研发出一种敏感性和特异性均较好，可以检测口蹄疫病毒中和抗体，且价格低廉的国产口蹄疫病毒中和抗体检测试剂盒，意义重大。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于a型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断elisa试剂盒及其应用。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
3、本专利技术的一种用于a型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断elisa试剂盒，所述的液相阻断elisa试剂盒中包含a型口蹄疫病毒中和抗体ab1、a型口蹄疫病毒样颗粒(vlps)抗原以及生物素标记的ab1抗体，其中，所述的a型口蹄疫病毒中和抗体ab1的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、其中，优选的，所述的a型口蹄疫病毒样颗粒(vlps)抗原按照公开号为cn109799343a，专利技术名称为“基于病毒样颗粒的a型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒”的专利申请中记载的方法进行制备。
5、其中，优选的，所述的液相阻断elisa试剂盒中还包含生物素标记的ab1抗体、hrp标记的链霉亲和素、显色液以及终止液。
6、进一步的，本专利技术还提出了所述的用于a型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断elisa试剂盒在制备检测a型口蹄疫病毒中和抗体试剂中的应用。以及所述的用于a型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断elisa试剂盒在评价a型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用中的应用。
7、再进一步的，本专利技术提出了一种使用所述的试剂盒评价a型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用的方法，包括以下步骤：
8、(1)将a型口蹄疫病毒中和抗体ab1用碳酸盐缓冲溶液(0.1mol/l，ph9.2)稀释后，加入酶标板中，每孔100μl，4℃包被过夜；
9、(2)另准备96孔血清稀释板，将待评价疫苗免疫后的动物血清用pbst从1:4的初始梯度开始2倍稀释，每孔50μl，稀释完毕后每孔同时各加入a型口蹄疫病毒vlps抗原进行反应，手动或用微量振荡器震荡混匀30s-60s，4℃过夜，得到待检血清-vlps抗原混合物；
10、(3)次日将步骤(1)酶标板中的液体倒掉，加入pbst洗涤3-4次，吸水纸上拍干；之后将待检血清-vlps抗原混合物按照原位每孔50μl移入含有包被抗体ab1的96孔板中，室温反应60min；
11、(4)将步骤(3)酶标板中的液体倒掉，加入pbst洗涤3-4次，吸水纸上拍干；每孔加入生物素标记的ab1抗体对未被中和的衣壳进行识别，室温反应60min；
12、(5)将步骤(4)酶标板中的液体倒掉，加入pbst洗涤3-4次，吸水纸上拍干；加入hrp标记的链霉亲和素，室温反应60min；
13、(6)将步骤(5)酶标板中的液体倒掉，加入pbst洗涤3-4次，吸水纸上拍干；每孔加入底物tmb，室温显色3min，每孔加入终止液混匀，酶标仪上450nm处读取酶标孔中样品od值。
14、其中，优选的，所述的a型口蹄疫病毒中和抗体ab1的包被浓度为0.25～2μg·ml-1，a型口蹄疫病毒vlps抗原的浓度为0.8-2.5μg·ml-1、生物素标记的ab1抗体的浓度为0.25～0.5μg·ml-1，hrp标记的链霉亲和素的浓度为0.25-0.5μg·ml-1。
15、其中，优选的，所述的a型口蹄疫病毒中和抗体ab1的包被浓度为1μg·ml-1，a型口蹄疫病毒vlps抗原的浓度为2μg·ml-1。
16、其中，优选的，所述的pbst为含0.05％v/v tween20的10mm磷酸盐缓冲液，ph 7.4。
17、相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：
18、本专利技术基于自主研发制备的a型口蹄疫病毒中和抗体ab1抗体和a型口蹄疫病毒vlps抗原，研发出一种敏感性和特异性均较好，可以检测a型口蹄疫病毒中和抗体，且价格低廉的国产a型口蹄疫病毒中和抗体检测试剂盒，能够方便的用于评价疫苗诱导的抗体是否具有保护作用，其检测结果与传统vnt方法检测结果具有很高的符合率(95.3％)。
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1.一种用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述的液相阻断ELISA试剂盒中包含A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1、A型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)抗原以及生物素标记的Ab1抗体，其中，所述的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述的A型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)抗原按照公开号为CN109799343A，专利技术名称为“基于病毒样颗粒的A型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒”的专利申请中记载的方法进行制备。
3.如权利要求1所述的用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述的液相阻断ELISA试剂盒中还包含HRP标记的链霉亲和素、显色液以及终止液。
4.权利要求1-3任一项所述的用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELISA试剂盒在制备检测A型口蹄疫病毒中和抗体试剂中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的用于A型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断ELIS
6.一种使用权利要求1-3任一项所述的试剂盒评价A型口蹄疫疫苗诱导的抗体是否具有保护作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的包被浓度为0.25～2μg·mL-1，A型口蹄疫病毒VLPs抗原的浓度为0.8-2.5μg·mL-1，生物素标记的Ab1抗体的浓度为0.25～0.5μg·mL-1，HRP标记的链霉亲和素的浓度为0.25-0.5μg·mL-1。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的A型口蹄疫病毒中和抗体Ab1的包被浓度为1μg·mL-1，A型口蹄疫病毒VLPs抗原的浓度为2μg·mL-1。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的PBST为含0.05％v/v Tween20的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
...【技术特征摘要】
1.一种用于a型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断elisa试剂盒，其特征在于，所述的液相阻断elisa试剂盒中包含a型口蹄疫病毒中和抗体ab1、a型口蹄疫病毒样颗粒(vlps)抗原以及生物素标记的ab1抗体，其中，所述的a型口蹄疫病毒中和抗体ab1的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.如权利要求1所述的用于a型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断elisa试剂盒，其特征在于，所述的a型口蹄疫病毒样颗粒(vlps)抗原按照公开号为cn109799343a，发明名称为“基于病毒样颗粒的a型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒”的专利申请中记载的方法进行制备。
3.如权利要求1所述的用于a型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断elisa试剂盒，其特征在于，所述的液相阻断elisa试剂盒中还包含hrp标记的链霉亲和素、显色液以及终止液。
4.权利要求1-3任一项所述的用于a型口蹄疫病毒中和抗体检测的液相阻断elisa试剂盒在制备检测a型口蹄疫病毒中和抗体试剂中的应用。
【专利技术属性】
技术研发人员：孙世琪，张韵，郭慧琛，董虎，李昊洲，白满元，尹双辉，滕志东，谭书桢，吴金恩，周静静，魏甜，丁耀忠，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心，
类型：发明
国别省市：
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