【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪流行性腹泻病毒s1蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用。本专利技术属于动物病毒学和动物基因工程。
技术介绍
1、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)是引起猪急性肠道感染的重要病原体，具有高度传染性，主要引起感染猪腹泻和呕吐。其对新生仔猪致死率极高，造成了养猪业巨大的经济损失。目前，对于pedv的防治仍以预防为主。商业化的pedv疫苗包括减毒活疫苗和灭活疫苗。这些商业化疫苗虽被广泛使用，但并不是所有的母猪都能产生较强的泌乳免疫。已有报告对亚洲使用的pedv疫苗的效果和安全性产生质疑，因此，急切需要研发pedv的新型疫苗。
2、随着纳米科学的发展，越来越多的自组装对称性纳米蛋白骨架(纳米笼)被设计出来。利用天然蛋白质开发出的纳米笼结构具有更高的稳定性，在生物医学如疫苗、药物递送等方面应用广泛，发展前景广阔。纳米颗粒疫苗由于将抗原附着在较大的支架上，提高了apc在淋巴滤泡中的摄取和保留。其可使抗原重复阵列，能够使多个b细胞受体有效地结合和激活。从而更好的激活机体特异性免疫反应，从而起到同灭活苗和弱毒苗相同的保护作用，同时由于纳米抗原不含有遗传物质，所以不存在感染，突变等安全隐患。
3、作为pedv的主要抗原蛋白，刺突纤突(s)能识别并介导进入宿主细胞，暴露在病毒表面。这个关键的进入因子被认为是病毒与宿主和组织嗜性的主要决定因素。s蛋白可分为s1和s2蛋白两部分，其中s1具有高度免疫原性和能产生中和抗体，是疫苗研究的重要靶蛋白。
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技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒s1纳米颗粒及其制备方法和应用，本专利技术利用毕赤酵母表达系统表达抗原可促进纳米颗粒的正确折叠，提高可溶性表达，同时又兼顾了毕赤酵母表达系统表达效率高，成本低等优点。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、首先，本专利技术提供了一种猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒，所述s1蛋白三聚体纳米颗粒包括通过连接肽连接的猪流行性腹泻病毒的s1蛋白和天然蛋白质骨架蛋白，所述的天然蛋白质骨架蛋白为人i型(α)胶原蛋白c端前肽。
4、其中，优选的，在连接前还包括对所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白和所述的天然蛋白质骨架蛋白进行密码子优化，所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白经密码子优化后得到的基因核苷酸序列如seq id no.1所示。
5、本专利技术所述天然蛋白质骨架蛋白优选为通过计算筛选并对天然蛋白质进行位点改造，得到的超稳定蛋白纳米骨架，具体由3个亚基自组装而成，模仿病毒s蛋白在自然状态下的三聚体状态。并且蛋白骨架n末端向外伸展，可灵活进行基因融合；纳米笼结构稳定，基因融合具有高效性；具有较大内部体积，纳米笼入口/出口通道可控；可携带多种功能蛋白。通过自组装蛋白骨架进行抗原的展示，可以增强抗原免疫原性，引发更强的体液、细胞免疫反应，可作为一种理想的疫苗平台。在本专利技术中，所述天然蛋白质骨架蛋白经密码子优化后得到的基因核苷酸序列优选如seq id no.2所示。本专利技术利用蛋白骨架的自组装特性以及n端的可修饰性，将pedv s1结构蛋白展示在蛋白骨架的外表面，从而获得具有较高免疫效力及较高稳定性的猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒抗原。其中，优选的，所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒的编码基因核苷酸序列如seq id no.3所示。
6、其中，优选的，所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒是通过毕赤酵母表达系统表达后，再通过体外组装获得的。
7、其次，本专利技术还提供了所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
8、(1)分别对猪流行性腹泻病毒的s1蛋白和天然蛋白质骨架蛋白进行密码子优化，将二者通过连接肽连接后，然后插入到载体ppink-hc中，得到重组质粒ppink-s1；
9、(2)将步骤(1)所述的重组质粒ppink-s1转入毕赤酵母感受态中，得到含有重组质粒ppink-s1的重组表达菌株；
10、(3)对步骤(2)所述的重组表达菌株进行真核表达，纯化后体外组装，得到猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒。
11、其中，优选的，步骤(1)中，猪流行性腹泻病毒的s1蛋白和天然蛋白质骨架蛋白进行密码子优化以及连接肽连接后得到的序列如seq id no.3所示，将seq id no.3所示的核苷酸序列插入到载体ppink-hc的ecor i和kpn i酶切位点之间。
12、其中，优选的，步骤(2)所述转化时，将每80μl的毕赤酵母感受态与10ug的重组ppink-s1质粒混合。
13、其中，优选的，步骤(3)所述纯化包括在所述酵母表达后，对收集得到的菌体沉淀进行超声裂解，将裂解产生的上清液进行镍柱亲和层析纯化。
14、其中，优选的，步骤(3)所述体外组装包括将纯化后的重组蛋白置于透析袋中，在500ml组装缓冲液中进行组装，所述500ml组装缓冲液为含有200mm nacl的40mm tris-hcl溶液，ph 8.0。
15、再次，本专利技术还提供了所述猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒在制备预防猪流行性腹泻病毒引起疾病的疫苗中的应用。
16、相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：
17、本专利技术提供了一种猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒，其是将pedv结构蛋白s1和天然蛋白质纳米骨架蛋白通过连接肽连接后，并在毕赤酵母表达系统中融合表达，进而组装后得到的。本专利技术利用蛋白骨架的自组装特性以及n端的可修饰性，将pedv s1结构蛋白展示在蛋白骨架的外表面，获得了具有较高免疫效力及较高稳定性的猪流行性腹泻纳米颗粒抗原。本专利技术的流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒可用于制备预防由pedv感染引起疾病的疫苗，为pedv的预防和治疗提供了新的技术手段。
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1.一种猪流行性腹泻病毒S1蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，所述S1蛋白三聚体纳米颗粒包括通过连接肽连接的猪流行性腹泻病毒的S1蛋白和天然蛋白质骨架蛋白，所述的天然蛋白质骨架蛋白为人I型胶原蛋白C端前肽。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S1蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，在连接前还包括对所述的猪流行性腹泻病毒S1蛋白和所述的天然蛋白质骨架蛋白进行密码子优化，所述的猪流行性腹泻病毒S1蛋白经密码子优化后得到的基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述的天然蛋白质骨架蛋白经密码子优化后得到的基因核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S1蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒S1蛋白三聚体纳米颗粒的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的猪流行性腹泻病毒S1蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒S1蛋白三聚体纳米颗粒是通过毕赤酵母表达系统表达后，再通过体外组装获得的。
5.权利要求1～4任一项所述的猪流行性腹
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，猪流行性腹泻病毒的S1蛋白和天然蛋白质骨架蛋白进行密码子优化以及连接肽连接后得到的序列如SEQ ID NO.3所示，将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列插入到载体pPink-HC的EcoR I和Kpn I酶切位点之间。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述转化时，将每80μL的毕赤酵母感受态与10ug的重组质粒pPinK-S1混合。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述纯化包括在所述酵母表达后，对收集得到的菌体沉淀进行超声裂解，将裂解产生的上清液进行镍柱亲和层析纯化。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述体外组装包括将纯化后的重组蛋白置于透析袋中，在500mL组装缓冲液中进行组装，所述500mL组装缓冲液为含有200mM NaCl的40mM Tris-HCl溶液，pH 8.0。
10.权利要求1～4任一项所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白三聚体纳米颗粒在制备预防猪流行性腹泻病毒引起疾病的疫苗中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，所述s1蛋白三聚体纳米颗粒包括通过连接肽连接的猪流行性腹泻病毒的s1蛋白和天然蛋白质骨架蛋白，所述的天然蛋白质骨架蛋白为人i型胶原蛋白c端前肽。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，在连接前还包括对所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白和所述的天然蛋白质骨架蛋白进行密码子优化，所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白经密码子优化后得到的基因核苷酸序列如seq idno.1所示，所述的天然蛋白质骨架蛋白经密码子优化后得到的基因核苷酸序列如seq idno.2所示。
3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒的编码基因核苷酸序列如seq id no.3所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒是通过毕赤酵母表达系统表达后，再通过体外组装获得的。
5.权利要求1～4任一项所述的猪流行性腹泻病毒s1蛋白三聚体纳米颗粒的制备方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙世琪，白满元，李林杰，郭慧琛，尹双辉，滕志东，王运航，张韵，吴金恩，丁耀忠，周静静，董虎，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心，
类型：发明
国别省市：
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